D-阿洛糖的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及由来自属于链霉菌属（Streptomyces)的微生物的序列号1或序列号2 所记载的氨基酸序列构成的蛋白质的新型用途，即将D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖的酶 的用途。
[0002] 本发明明确了属于链霉菌属(Streptomyces)的微生物生产的上述酶所具有的催 化糖异构化反应的催化剂功能，涉及利用该新型催化剂功能生产D-阿洛糖的技术。
【背景技术】
[0003]单糖类根据还原基（羰基）的状态可以大致分为醛糖（具有醛基作为羰基的糖）、 酮糖（具有酮基作为羰基的糖）、糖醇（别名：多元醇，不具有羰基的糖）。单糖类中具有被 称为"稀少糖"的糖。稀少糖根据国际稀少糖学会的定义被定为自然界只稀少地存在的糖， 根据其种类，多数有机化学合成方法中的收率也少。因此，现状是寻求包括阿洛糖的己醛糖 (醛糖）稀少糖的有效的制造方法的开发和其特异的性质。
[0004] 已知稀少糖具有生理活性。例如，公开了以D-阿洛糖的衍生物为有效成分的抗肿 瘤剂（专利文献1)，利用糖类对活性氧的性质的情况，例如，已知有含有具有抑制活性氧的 性质的多糖类的活性氧产生抑制剂（专利文献2)。
[0005] 阿洛酮糖是具有酮基作为还原基的六碳糖，近年来，由于表异构酶的出现而成为 比较容易得到的糖。暗示了D-阿洛酮糖能够有效地利用为甜味料、发酵用碳源、试剂、化妆 品?医药品的原料?中间体等。阿洛酮糖的作为试剂?医药品等的中间原料的应用例，例 如，报告有以D-阿洛酮糖作为原料的乙内酰脲衍生物的合成例（非专利文献1)。
[0006]D-阿洛糖可以由D-阿洛酮糖制造。例如，与利用了作为能够由D-阿洛酮糖生产 D-阿洛糖的酶的异构酶的D-阿洛糖的制造相关的专利文献中，例如有一种精制稀少糖的 大量生产方法，其特征在于，通过对异构化进行催化的酶的作用由基质稀少糖转换为目标 稀少糖，通过模拟移动床将得到的原液连续地色谱分离为目标稀少糖组分（专利文献3)。 或者，提出了使来自施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)(IPODFERMBP-08593)的具有 L_鼠李糖异构酶活性的蛋白质作用异构化为D-阿洛糖的D-阿洛糖的生产方法（专利文献 4)〇
[0007] 另外，提出了使D-木糖?异构酶作用于含有D-阿洛酮糖和/或L-阿洛酮糖的溶 液，由D-阿洛酮糖生成D-阿洛糖和D-阿卓糖，由L-阿洛酮糖生成L-阿卓糖，采集选自这 些D-阿洛糖、D-阿卓糖以及L-阿卓糖中的1种或2种以上的己醛糖的己醛糖的制造方法 (专利文献5)。
[0008] 现有技术文献
[0009] 专利文献
[0010] 专利文献1:日本特公昭59-40400号
[0011] 专利文献2:日本特开平07-285871号公报
[0012] 专利文献3 :日本特开2006-153591号公报
[0013] 专利文献4:日本特开2008-109933号公报
[0014] 专利文献5:日本特开2002-17392号公报
[0015] 专利文献6 :国际公开W02007-058086号
[0016] 专利文献7:美国专利5, 620, 960(1999)
[0017] 专利文献8:日本特开2009-153516号公报
[0018] 非专利文献
[0019]非专利文献 1 :Tetrahedron，47，No. 12/13，p2113(1991)
[0020] 非专利文献 2 :J.Bacteriol.，73:410-414 (1956)
[0021] 非专利文献 3 :J.BiosciBioeng.，96:89-91 (2003)
[0022] 非专利文献 4:Davisetal.，BASICMETHODSINMOLECULARBIOLOGY, 1986
[0023]非专利文献 5:MethodsCarbohydr.Chem.，1:102-104 (1962)
[0024]非专利文献 6 :Carbohydr.Res.，24:192-197 (1972)
[0025]非专利文献 7 :J.FermentBioeng.，8:539_541 (l"8)
[0026]非专利文献 8 :J.Mol.Biol. ,300:917-933 (2000)
【发明内容】
[0027] 发明所要解决的技术问题
[0028] -直以来虽然开发了由各种微生物制造D-阿洛糖的技术，但是由于该微生物的 安全性方面有问题，所以难以在D-阿洛糖的生产中实用化。因此，一直以来寻求使用来自 安全性没有问题的微生物的酶生产稀少糖。
[0029] 关于稀少糖的制造，例如，已知有通过利用来自菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)的D-己酮糖3-表异构酶可以由D-果糖制造D-阿洛酮糖。然而，由于菊苣假单 胞菌是植物病原性微生物，因此，不能说其适合利用于食品用途。也提出了通过属于根瘤菌 属的微生物来制造D-阿洛酮糖（专利文献6)，但是属于根瘤菌属的微生物也是植物病原性 微生物，作为用于食品用途的菌不优选。另外，这些技术都是生产D-阿洛酮糖的技术，不是 生产D-阿洛糖的而技术。
[0030] 为了解决与这样的现有技术的安全性相关的问题，本发明的目的在于从能够推测 出确认能用于制造食品时的现有的添加物名单收载品种目录中所收载的菌种且几乎没有 毒性的菌种中，取得以高收率对由D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖进行催化的异构酶，并提 供使用了该酶的D-阿洛糖的制造方法。
[0031] 另外，本发明提供一种通过由可以作为现有的添加物对食品的制造没有问题地使 用的可能性高的放线菌得到的新型的酶来制造D-阿洛糖的方法。
[0032] 解决技术问题的技术手段
[0033] 本发明者们寻求没有作为这样的现有技术的技术问题的安全性相关的担忧的生 产D-阿洛糖的微生物、即微生物生产的该酶，进行了重复研宄，由此，完成了本发明。即，本 发明是基于从土壤中分离放线菌制作库，从其中发现了具有从D-阿洛酮糖转换为D-阿洛 糖的作用的酶而成的。由于放线菌可以作为现有的添加物酶的起源微生物食品制造上没有 问题地使用的可能性高，因此，由放线菌得到的异构酶能够作为非常有用的D-阿洛糖的大 量生产的手段。
[0034] 即，本发明以以下的（1)~（3)中记载的具有活性的蛋白质为要点。
[0035] (1) -种蛋白质，其中，具有如下的活性：识别醛糖C1的CH0基团和C2的0H基团 并进行反应，将C1的CH0基团转变为0H基团，将C2的0H基团转变为C0基团；或者识别酮 糖C1的0H基团和C2的C0基团并进行反应，将C1的0H基团转变为CH0基团，将C2的C0 基团转变为0H基团；
[0036] 并且，所述蛋白质是下述（a)至（c)中任一记载的蛋白质：
[0037] (a)由序列号1或序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质；
[0038] (b)由序列号1或序列号2所示的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸残基被置换、 添加、插入或缺失而成的氨基酸序列构成的蛋白质；
[0039] (c)由与序列号1或序列号2所示的氨基酸序列具有60%以上的同源性的氨基酸 序列构成的蛋白质。
[0040] (2)如上述⑴所述的蛋白质，其中，将酮糖的D-阿洛酮糖异构化为醛糖的D-阿 洛糖。
[0041] (3)如上述⑴或⑵所述的蛋白质，其中，所述蛋白质是由以下⑷~（f)的物 理化学性质特定的，
[0042] (d)作用pH和最适pH，
[0043] 作用pH为 6.0 ~11.0,最适pH为 9.0 ;
[0044] (e)作用温度和最适温度，
[0045] 作用温度为10~80°C，最适温度为60°C;
[0046] (f)对于L-鼠李糖、D-木糖、D-核糖、D-阿洛糖、D-葡萄糖以及L-阿拉伯糖有反 应性。
[0047] 另外，本发明的要点还在于⑷所记载的DNA、（5)所记载的重组载体、（6)所记载 的宿主细胞、以及（7)所记载的重组蛋白质的制造方法。
[0048] (4) 一种来自链霉菌(Streptomycessp. ) 710 (保藏号：NITEBP-01423)或链霉菌 (Streptomvcessp.) 720 (保藏号：NITEBP-01424)的DNA，其中，编码由序列号3或序列号 4所示的碱基序列或其互补序列、或者包含这些序列的一部分或全部的序列构成的权利要 求1或2所述的蛋白质。
[0049] (5) -种重组载体，其中，包含上述⑷所述的DNA。
[0050] (6) -种宿主细胞，其中，包含能够表达上述（1)、⑵或⑶所述的蛋白质的表达 体系。
[0051] (7) -种重组蛋白质的制造方法，其特征在于，在培养基中培养上述（6)所述的包 含表达体系的宿主细胞，从得到的培养物中采取上述（1)、（2)或（3)所述的重组蛋白质。
[0052] 另外，本发明的要点还在于以下（8)至（12)的D-阿洛糖的生产方法。
[0053] (8) -种D-阿洛糖的生产方法，其特征在于，使上述（1)、⑵或⑶所述的蛋白 质作用于D-阿洛酮糖，将D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖。
[0054] (9)如上述⑶所述的D-阿洛糖的生产方法，其中，D-阿洛酮糖是将D-果糖表异 构化来生产的。
[0055] (10)如上述⑶所述的D-阿洛糖的生产方法，其中，D-阿洛酮糖是将D-葡萄糖 异构化转变为D-果糖，将该D-果糖表异构化来生产的。
[0056] (11)如上述⑶所述的D-阿洛糖的生产方法，其中，D-阿洛酮糖是由未利用资源 得到D-葡萄糖，将该D-葡萄糖异构化转变为D-果糖，将该D-果糖表异构化来生产的。
[0057] (12)如上述⑶~（11)中任一项所述的D-阿洛糖的生产方法，其中，作为目标的 D-阿洛糖为D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的混合物。
[0058] 发明的效果
[0059] 根据本发明，即通过使用来自属于链霉菌属(Streptomyces)的微生物的酶蛋白 质，从而能够识别醛糖C1的CH0基团和C2的0H基团并进行反应，将C1的CH0基团转变为 0H基团，将C2的0H基团转变为C0基团；或者识别酮糖的C1的0H基团和C2的C0基团并 进行反应，将C1的0H基团转变为CH0基团，将C2的C0基团转变为0H基团，优选能够由 D-阿洛酮糖生产D-阿洛糖。本发明可以提供由来自属于链霉菌属(Streptomyces)的微生 物的序列号1或序列号2所记载的氨基酸序列构成的酶，所述酶识别醛糖C1的CH0基团和 C2的0H基团并进行反应，将C1的CH0基团转变为0H基团，将C2的0H基团转变为C0基 团；或者识别酮糖的C1的0H基团和C2的C0基团并进行反应，将C1的0H基团转变为CH0 基团，将C2的C0基团转变为0H基团，优选将D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖，另外，通过 使用所述酶可以生产D-阿洛糖。
[0060] 根据本发明，能够使用菌体培养物的安全性非常高的菌是很大的技术进步，将 D-阿洛酮糖异构化生产D-阿洛糖的酶及其制造方法的确立不仅在制糖产业，在与其相关 的食品、化妆品、医药品产业中的工业意义也极大。另外，本发明能够以最廉价可以大量取 得的D-葡萄糖、或者果糖为原料经由D-阿洛酮糖制造D-阿洛糖。
【附图说明】
[0061] 图1是表示实施例1的重组型异构酶的