抗人proBDNF单克隆抗体及其在疼痛中的作用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗人脑源性神经营养因子前体蛋白（proBDNF)单克隆抗体的制备领 域，W及所述单克隆抗体在减缓和/或抑制各类急性、慢性疼痛，比如手术后疼痛，急性炎 性疼痛，慢性炎性疼痛、幻肢痛、糖尿病源性疼痛、神经病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内脏 痛、癌性疼痛、关节炎性疼痛、头面痛、H叉神经痛、偏头痛，复杂区域综合症等中的作用。
【背景技术】
[0002] 疼痛是继体温、呼吸、也率，血压之后第五大生命体征，其可作为机体受到伤害的 一种警告引起机体一系列防御性保护反应。但过度的疼痛会对机体本身造成损害，并成为 机体一种难W忍受的折磨。因此，镇痛（analgesia)是医务工作者面临的重要任务。慢性 疼痛一直威胁着人类的生存和生活质量，同时也对家庭和社会造成很大的负担。据美国疼 痛协会报道，美国慢性疼痛的患病率估计为35. 5%，达1. 05亿人。每年花费超1000亿美元， 直接导致了医疗保健支出消耗和工作时间的损失。
[0003]目前最常用的镇痛药包括对己醜氨基酷、非留体消炎镇痛药和阿片样受体激动剂 如曲马多和吗啡等。非留体抗炎药（NSAIDs)镇痛效能较弱，且有可能导致胃肠道出血、肾 衰及肝功能损害等副作用；而阿片类药物剂量过大可呼吸抑制，而长期使用则导致便秘、滥 用、依赖及成癒等副作用。近些年来，也有另外一些镇痛药也进入了市场，如抗抑郁药巧口礼 来公司的度洛西汀)、抗惊厥药巧日辉瑞公司的产品普瑞加林，商品名乐瑞卡）和选择性环氧 合酶2 (C0X-2)幼日辉瑞公司的帕瑞昔布）抑制剂等。
[0004] 一种新的镇痛药物开发的模式是机制介导的药物新祀点开发，该主要通过对疼痛 的机制探讨，寻找调控疼痛发生和发展的重要因子或祀点，从而开发对其干预达到镇痛作 用的新药物。该种基于基础研究成果转化的临床应用目前正在被大量试验，然而成功例子 少之又少。
[0005] 其中，一个典型的例子是抗神经生长因子（NerveGrowthFactor,NGF)抗体的开 发。NGF是神经营养因子家族成员，在发育中对神经元的生存及调亡起着重要的作用。大 量的基础研究显示NGF可促进疼痛进程，因此阻断NGF可能是治疗疼痛重要的方法。因此 对NGF抗体的研发非常多，其中包括了Tanezum油（辉瑞)、SAR164877/REGN475 (赛诺菲/ Regeneron)和NJ-42160443/AMG403 (强生公司/安进公司）。虽然，该些药物在动物模型 上显示出镇痛效果，临床I/II期也显示出有临床安全性及镇痛效果，然而在临床III期试 验中，NGF抗体联合NSAID药物对类风湿性关节炎及强直性脊柱炎等病人镇痛作用的临床 疗效和安全性评价中，少数病人出现无痛性缺血性股骨头坏死（GarberKFateofnovel painkillermAbshangsinbalance.NatBiotechnol2011， 173-174 ；SeidelM,Lane N,ControlofArthritisPainwithAnti-Nerve-GrowthFactor,民iskandBenefit, CurrRheumatolR邱，2012,583-585)。
[0006] 因此，对新作用机制镇痛剂的开发仍然存在着巨大的市场需求。
[0007] 脑源性神经营养因子抓NF(brainderivedneurotrophicfactor)是继神经生 长因子之后被发现的神经营养因子，分子量为12. 4kDa，主要分布于中枢神经系统中，但在 周围神经系统也有BDNF的合成，在调节神经元存活、分化、突触可塑性W及损伤修复等方 面具有重要功能。目前有证据显示抓NF不仅是调控神经系统发育和情感障碍的重要因子， 同时也是重要的痛觉调质。
[0008] 脑源性神经营养因子的前体pro抓NF(precursorforbrain-derived neurotrophicfactor)是由抓NF基因经过转录、翻译后在内质网内合成的其肤链长度为 247个氨基酸，氨基酸序列理论分子量为27. 8KD，但是由于蛋白糖基化修饰程度不同，分子 量可W在32-36kD的范围内。Pro抓NF的分子氨基酸序列第1-18位点是信号肤序列，在分 泌的过程中产生2个片段，其中一个片段是包含序列第19-129位氨基酸即前体结构域的多 肤片段，称为前体结构域（proBDNFpro-domain)，另一个片段则是氨基酸序列第130-247 即成熟结构域所编码的片段，经加工后形成有生物活性的成体抓NF。
[0009]目前大量证据显示pro抓NF不仅作为成熟抓NF合成的中间产物，也可作为配体与 其高亲和力受体p75神经营养因子受体（P75neurotrophinreceptor,p75NTR)结合发挥 生物学功效。目前proBDNF-p75NTR信号通路在疼痛中的作用尚不清楚，然而有观点认为疼 痛的脊髓敏感化机制与海马的长时程增强（Long-termpotentiation,LT巧/长时程抑制 (long-termdepression,LTD)形成机制相似而抓NF-TrkB及pro抓NF-p75NTR信号通路则 是调控LTP/LTD的重要信号分子。
[0010] 中南大学张艳玲2012年实验研究表示；大鼠后足切割后，其背根神经节pro抓NF 表达上调；大鼠后足注射pro抓NF腺病毒载体后，该腺病毒载体在神经纤维上大量表达 pro抓NF，过表达的pro抓NF导致大鼠后足机械刺激缩足阔值明显降低和足底组织的炎症 反应；利用腹腔给予抗proBDNF多克隆抗体后增加大鼠后足切割后的缩足阔值。
[0011] 切割痛属于急性疼痛。急性和慢性疼痛均可W出现外周敏感化和中枢敏感化，两 者之间区别在于外周敏感化中局部组织神经纤维或轴突释放的递质及细胞内信号通路不 同，同时在背根神经节相关的痛觉递质W及信号传导通路也有所不同，后者持续的时间也 更长；另外，中枢敏感化中，脊髓胶质细胞的持续激活时可能也是急慢性疼痛机制两者之间 最重要的区别之一。
【发明内容】
[0012] 本发明一方面涉及特异性识别pro-BDNF蛋白前体结构域第19位至第128位氨 基酸的抗体多肤，其包括包含如下氨基酸序列的重链可变区；（a)如SEQIDNO: 1所示的 CDR1区域，如SEQIDNO: 2所示的CDR2区域，（C)如SEQIDNO: 3所示的CDR3区域，和/ 或包含如下氨基酸序列的轻链可变区；（d)如SEQIDNO: 4所示的CDR1区域，（e)如SEQ IDNO: 5所示的CDR2区域，（f)如SEQIDNO: 6所示的CDR3区域。
[0013] 在一个具体实施方案中，所述抗体多肤为单克隆抗体。在更具体的实施方案中， 所述抗体多肤为重链可变区氨基酸序列为SEQIDNO: 7,轻链可变区氨基酸序列为SEQID N0:8。在另一具体的实施方案中，所述抗体多肤具有重链氨基酸序列为SEQIDN0:9,轻链 氨基酸序列为SEQIDN0:10。在另一个具体实施方案中，所述的抗体多肤可W选自人源化 的抗体多肤，嵌合的抗体多肤，亲和力成熟的抗体多肤，或其一种或多种的组合。在另一个 具体实施方案中，所述的抗体多肤为与上述抗体多肤竞争的抗体多肤。
[0014] 本发明另一方面涉及编码上述抗体多肤的核酸序列。在一个具体的实施方案中， 其中编码所述抗体多肤的重链可变区氨基酸序列的核酸为SEQIDN0:11所示，其中编码轻 链可变区氨基酸序列的核酸为SEQIDN0:12所示。在另一个具体实施方案中，其中编码所 述抗体多肤的重链氨基酸序列的核酸为SEQIDN0:13所示，其中编码轻链氨基酸序列的核 酸为SEQIDNO: 14所示。
[0015] 本发明另一方面涉及包含所述核酸序列的载体。
[0016] 本发明另一方面涉及包含所述载体的宿主。
[0017] 本发明另一方面涉及特异性识别pro-BDNF前体结构域的一种或多种抗体多肤在 制备减缓和/或抑制选自如下慢性疼痛的药物中的应用：慢性炎性疼痛、幻肢痛、糖尿病源 性疼痛、神经病理性疼痛、慢性腰背痛、慢性内脏痛、癌性疼痛、关节炎性疼痛、头面痛、H叉 神经痛、偏头痛，复杂区域综合症，及其组合。
[0018] 本发明另一方面涉及所述抗体多肤在制备减缓和/或抑制选自如下疼痛的药物 中的应用；手术后疼痛，急性炎性疼痛，慢性炎性疼痛、幻肢痛、糖尿病源性疼痛、神经病理 性疼痛、慢性腰背痛、慢性内脏痛、癌性疼痛、关节炎性疼痛、头面痛、H叉神经痛、偏头痛， 复杂区域综合症，及其组合。
[0019] 本发明另一方面涉及包含有效量的所述抗体多肤的药物组合物。在一个具体实施 方案中，所述药物组合物通过静脉或腹腔注射方式给药。
[0020] 本发明的抗体多肤和相应的药物组合物，能够特异性识别pro抓NF的前体结构域 (pro-domain),表现出不仅抑制和/或预防各类急性，还可W抑制和/或预防慢性疼痛，比 如手术后疼痛，急性炎性疼痛，慢性炎性疼痛、幻肢痛、糖尿病源性疼痛、神经病理性疼痛、 慢性腰背痛、慢性内脏痛、癌性疼痛、关节炎性疼痛、头面痛、H叉神经痛、偏头痛，复杂区域 综合症，获得了现有技术不曾达到的技术效果，具有广泛和良好的临床应用前景。
【附图说明】
[0021] 图1显示本发明实施例1中宿主菌化21 (DE3)表达的人pro抓NF蛋白纯化后的 SDS-PAGE电泳结果。1，纯化的人pro抓NF蛋白；2,低分子量蛋白标记（ProteinMolecular Wei曲tMarker(Low),购自TAKARA,货号：：3450)。
[002引 图2显示本发明实施例2中肥K293F细胞表达的人pro抓NF前体结构域蛋白纯化 后的SDA-PAGE电泳结果。1，纯化的人前体结构域蛋白；2,低分子量蛋白标记低分子量蛋 白标记（ProteinMolecularWei曲tMarker(Low),购自TAKARA,货号：：3450)。
[0023] 图3显示本发明实施例3中肥K293F细胞表达的大鼠pro抓NF前体结构域融合蛋 白纯化后的SDA-PAGE电泳结果。1，纯化的大鼠pro抓NF前体结构域融合蛋白；2,低分子 量蛋白标记低分子量蛋白标记（ProteinMo