一种高效发酵生产l-丙氨酸的大肠杆菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种高效发酵生产k丙氨酸的大肠杆菌，属于微生物代谢工程技术 领域。
【背景技术】
[0002] k丙氨酸是最小的手性分子之一，被用于医药和兽药行业，与其他k型氨基 酸共同用作手术前和手术后的营养剂。由于心丙氨酸具有甜味，也被用于食品添加 剂。此外，丙氨酸也可用于合成改性耐热塑料，例如（PA)S、poly(ester-amide)s(PEA)s、 poly(ester-amide-sulfide)s(PEA巧sW及poly(ester-imide)s(PEI)s等。然而k丙氨 酸生产成本高，使其应用受到限制。
[0003] 近年来，利用基因工程手段，将外源丙氨酸脱氨酶基因引入E.coli菌 株，在E.coli中实现 了k丙氨酸的合成（LeeM.etal.,ApplMicrobiol Biotechnol, 2004, 65:56-60；SmithG.M.etal. ,BiotechnolLett,2006, 28:1695-1700 ； ZhangX.etal.,ApplMicrobiolBiotechnol, 2007, 77:355-366) 〇Smi1:h等（SmithG.M.et al.,BiotechnolLett, 2006, 28:1695-1700)将来源于Bacillussphaeri州s的alaD基 因克隆于质粒载体上，并在E.coliALS929(pflppspoxB1化AaceE巧菌株中表达，可利 用复杂培养基合成88g/L丙氨酸，丙氨酸合成阶段体积生产强度达到4g/L?h。化ang等 狂hangX.etal.,ApplMicrobiolBiotechnol, 2007, 77:355-366)将来源于Geobacillus stearothermo地ilus的alaD基因整合于重组E.coliSZ194染色体上，经驯化后，最终菌株 XZ132(pflBfrda化EackAmgsAdadX1化A::alaD)经4她发酵，可利用无机盐培养基W 及120g/L葡萄糖合成1279mmol丙氨酸，整个发酵过程中丙氨酸生产强度为2. 37g/L?!!，丙 氨酸转化率达到95g/100g葡萄糖，k丙氨酸光学纯度达到99. 5%，是目前利用重组E.coli 菌株进行k丙氨酸合成的最高产量。
[0004] 本发明W野生型E.coliB100为出发菌株，构建出高效合成k丙氨酸的新型 E.coli重组菌株。通过控制温度，在菌体生长阶段关闭重组菌株k丙氨酸的合成，避免产 物对菌体生长的抑制和竞争作用；在k丙氨酸合成阶段，高效开启k丙氨酸合成途径，W 葡萄糖为唯一碳源进行k丙氨酸的高水平合成，不需要添加一些昂贵的化合物进行诱导， 不需用惰性气体控制严格的厌氧环境，具有更好的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种能W廉价原料和粗放发酵条件，高效 生产高光学纯度和高化学纯度k丙氨酸的大肠杆菌62ALA。
[0006]所述菌株分类命名为大肠埃希氏菌巧scherichiacoli)，已于2015年3月16日， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏地址为北京市朝阳区北辰西 路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 10628。
[0007] 所述菌株的染色体上副产物己酸、甲酸、己醇、班巧酸、乳酸的合成途径编码基因 ackA-pta、pflB、a化E、frdA、1 化A被敲除。
[000引所述菌株的染色体上dadX基因处整合了来源于嗜热菌Geobacillus stearothermo地ilus的丙氨酸脱氨酶基因alaD。
[0009] 本发明还提供一种应用所述重组菌发酵生产k丙氨酸的方法，分两阶段控制发 酵温度，在第一阶段，控制较低培养温度，使菌体快速生长而不合成k丙氨酸，然后在第二 阶段，提高培养温度，进行k丙氨酸的合成。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，第一阶段在28~35°C好氧条件下培养菌体，使菌体 快速生长；至菌体生长到对数中后期，进入第二阶段，于40~45°C好氧培养菌体片刻，然后 进入限氧发酵产k丙氨酸的阶段。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，将活化后的大肠杆菌接种于装液量60%的发酵罐 中，进行两阶段发酵，（1)好氧阶段培养：初始空气通量为化/min,揽拌奖转速为2(K)r/min， 此时的溶解氧浓度设定为100%，菌体生长过程中调节空气通量直至化/min,同时将揽拌 转速与DO值关联来控制溶解氧浓度始终大于30%;使用NH4OH和10% (v/v)H2S〇4维持抑 值为7. 0,发酵温度控制为28~35°C ;当至菌体生长到对数中后期，升高温度至40~45°C 继续好氧培养45min，再进入限氧发酵产酸阶段；（2)限氧阶段培养：空气通量调为零，揽拌 奖转速控制为10化/min,添加NH4OH来维持抑值为7. 0,发酵温度为40~45°C，并补加S 次浓度为600g/L的葡萄糖，每次补加200mL，W维持发酵过程中发酵液残糖浓度高于lOg/ 以当所有补加的葡萄糖消耗尽后即结束发酵。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，发酵培养基成分为（/L) ;30g葡萄糖，15.llg 化2册〇4?12H2〇,3gKH2PO4,Ig畑典1，0. 5g化C1，13.2g(NH4)2S〇4,并补加 10/4 (v/v)Imol/ LM拆O4和1%。（v/v)的微量元素母液。微量元素成分为（/L) ;2.4gFeCl3'6H2〇,0. 3g CoCl2.6H2〇,0. 15gCuCl2.2H2〇,0. 3gZnCl2,0. 3gNa2M〇4.2H2〇,0. 075g&8〇3,0. 495g MnCla ? 4H2O0
[0013] 本发明的有益之处体现在：
[0014] 1、本发明提供的重组菌，在基因组中删除了合成副产物的基因，并整合了表达了 启动子及丙氨酸脱氨酶编码基因alaD，具有明显的高产心丙氨酸的能力，菌种在28~ 45°C的条件下发酵26h，产k丙氨酸水平达到106g/L或W上，整个发酵过程生产强度达到 4. 27g/L?hW上。
[0015] 2、本发明的心丙氨酸高产菌在心丙氨酸发酵中，基本没有有机酸等副产物W及 D-丙氨酸的合成，保障了k丙氨酸产品具有高化学纯度及高光学纯度。
[0016] 3、本发明的心丙氨酸高产菌利用葡萄糖为唯一碳源高效生产k丙氨酸，发酵过 程中不需添加特殊的底物或诱导剂，不需用惰性气体严格控制厌氧条件，具有生产成本低 的优点。
[0017] 生物材料保藏
[001引一种大肠埃希氏菌巧scherichiacoli)，已于2015年3月16日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中 国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 10628。
【附图说明】
[0019] 图1;大肠杆菌CGMCCNo. 10628丙氨酸发酵过程；:丙氨酸；?：细胞干重 值CW)。虚线箭头指示时间是培养温度由28~35°C转为40~45°C。虚线将发酵过程划分 为好氧培养阶段（左）和限氧培养阶段（右）。箭头表示分别向发酵罐中添加120g(A)、 120g做和120g似葡萄糖的时间。
【具体实施方式】
[0020] W下实施例设及的有关方法：
[0021] ①菌体量测定方法；菌体密度采用浊度法间接测量，通过0化。。来表示，并通过下 列公式换算为菌体干重。菌体干重值CW)和ODe。。的关系；100日。。=0. 38g/LDCW。
[002引②葡萄糖测定方法；葡萄糖用SBA-40E葡萄糖生物传感仪（山东省科学院生物研 究所）进行分析。
[002引⑨有机酸测定方法；有机酸含量用高压液相色谱进行分析，检测器为UV(210nm) 检测器，色谱柱为PrevailOrganicAcid5u(GraceDavisonDiscoverySciences),流动 相为25mmol/LKH2P04(pH2. 5)，流速为1血/min,柱温为室温。
[0024] ④氨基酸测定方法；样品适当稀释后再用苯基异硫酸醋（PITC)进行衍生。衍生 步骤为；500yL样品中加入250UL0.Imol/LPITC己膳溶液和250ULImol/LS己胺己 膳溶液，充分混匀，避光室温放置比，加入500yL正己烧溶液，祸旋振荡器振荡Imin，静置 60min，吸取下层溶液，用0. 45ym有机滤膜过滤后进行高压液相检测。色谱柱为AccQ'Tag 3. 9X150mm(Waters)。流动相A液为 80 % (v/v)己膳水溶液，B液为 97:3 (v/v)的 0.Imol/ L己酸钢-己膳溶液。采用梯度洗脱；0-20m