一种亮氨酸脱氢酶及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程和微生物技术领域，具体设及一种亮氨酸脱氨酶及其制备方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 亮氨酸脱氨酶化eucineDehy化ogenase,LeuDH,EC1. 4. 1. 9)是一种WNADH W及其氧化态为辅酶因子的氧化还原酶。该酶可催化k亮氨酸及其他支链L型氨基酸 的氧化，并有能力还原其对应酬酸成L型氨基酸。该酶最先由枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)中筛选而来，后来逐渐被发现存在于杆菌属、芽抱八叠球菌属、椿状杆菌属W 及高温放线菌属等。目前的高活性亮氨酸脱氨酶菌株已被筛选出来，并被应用于工业生 产，例如：球形赖安酸芽抱杆菌化ysinibacillussphaericus)、蜡样芽抱杆菌（Bacillus cereus)W及西伯利亚微小杆菌（Exiguobacteriumsibiri州m)等。
[0003] 由于嗜热酶在工业应用上具有较高的热稳定性，可为分离纯化和工业上的连续反 应过程提供便利，大大降低由于酶用量过高而产生的成本，嗜热酶便成为研究的热点。高温 放线糖莱斯菌（Laceyellasacchari)是兼性厌氧微生物，具有抗逆性強，易储存W及耐热 性好等独特性质，是一种近年来受到广泛关注的潜在淀粉高效利用工业价值。该菌可催化 断开淀粉中a-l，4糖巧键，并具有淀粉的液化和糖化能力。至此由该菌被广泛应用与纺织 品的脱浆工艺和烘赔工业等，且发酵过程易于控制、最适发酵温度高（55~65°C)。到目前为 止，还没有关于高温放线糖莱斯菌亮氨酸脱氨酶基因的报道，鉴于亮氨酸脱氨酶在催化制 备k亮氨酸、叔亮氨酸等方面的优势，选择高活性亮氨酸脱氨酶菌株对于工业化生产具有 重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种亮氨酸脱氨酶及其制备方法和应用，首次W高温放线糖 莱斯菌基因组为模板，扩增出亮氨酸脱氨酶基因，提供了一种与目前已知的亮氨酸脱氨酶 来源不同的新型亮氨酸脱氨酶，该亮氨酸脱氨酶在60°c，pHlO. 0条件下，纯酶液的酶活为 35. 93IU，比酶活为326. 63U/mg，在催化合成k氨基酸中具备明显的优势。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 一种亮氨酸脱氨酶，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0006] 编码所述亮氨酸脱氨酶的基因，其核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0007] -种表达载体，它包含所述的亮氨酸脱氨酶基因SEQIDNO. 2。
[0008] -种重组菌，其是通过利用所述的表达载体转化宿主细胞获得的。
[0009] 亮氨酸脱氨酶的制备方法，在营养培养基中培养所述的重组菌，收集具有亮氨酸 脱氨酶活性的多肤。
[0010] 所述的重组菌的构建方法为：将亮氨酸脱氨酶基因连接到表达质粒载体祀T2化 上，得到包含亮氨酸脱氨酶基因的重组质粒祀T2化-LeuDH，然后将重组质粒祀T2化-LeuDH 转化到大肠杆菌化21 (DE3)中，得到重组菌E.coli化21-pET22b-LeuDH。
[0011] 将重组菌E.coli化21-pET22b-LeuDH在含100yg/mL氨节青霉素的LB液体培养 基中37°C振荡培养10小时浪1% (v/v)的接种量吸取培养液转接到含100yg/mL氨节青 霉素的自诱导液体培养基中30°C进行培养；待ODewJi到1. 0后25°C低温培养6~12小时， 离屯、收集菌液，弃上清培养基，用抑=8的PBS缓冲等体积洗漆S次，加入PBS缓冲使得重悬 菌液ODewJi到20,混匀；用超声破碎仪破碎，10000巧m离屯、lOmin取上清粗酶液；粗酶液 用0.22ym膜过滤除去杂质，再采用亲和的介质填充层析柱镶柱对重组蛋白进行纯化，得 到亮氨酸脱氨酶。
[0012] 制备得到的亮氨酸脱氨酶，在25°C，抑10条件下比酶活为182. 62U/mg;在60°C， 抑10条件下比酶活为326. 63U/mg。
[0013] 所述自诱导培养基配方为；蛋白腺15g/l，酵母粉25g/l，氯化钢10g/l，葡萄糖2 g/l，乳糖 3g/L。
[0014] 所述的亮氨酸脱氨酶在制备L型氨基酸中的应用。
[0015] 本发明是W高温放线糖莱斯菌（Laceyellasacchari)基因组为模板，设计特异性 引物，扩增出亮氨酸脱氨酶基因，其氨基酸序列加序列表SEQIDNO. 1所示。其核巧酸序列 如SEQIDNO. 2所示。利用DNA重组技术将本发明得到的亮氨酸脱氨酶基因在原核细胞中 进行诱导表达，获得的重组亮氨酸脱氨酶共364个氨基酸，分子量为40~42kDa。
[0016] 通过Blast软件在线比较分析，发现来自于高温放线糖莱斯菌的亮氨酸脱氨 酶基因的核巧酸序列与其它微生物的己知亮氨酸脱氨酶基因的同源性差异较大，与 Thermoactinomycesintermedius、Bacilluscereusstrain、Bacillussphaericus的一 致性分别为81%、74%、71%。
[0017] 本发明中，术语"亮氨酸脱氨酶基因"还包括能编码具有与亮氨酸脱氨酶相同功能 的蛋白的SEQIDNO. 2的突变形式，所述突变类型包括：确实、无义、插入、错义。本领域技 术人员能够理解，作为遗传密码简并性的结果，许多不同的多核巧酸能够编码相同的多肤。 另外，应当理解，本领域技术人员能够使用常规的技术进行核巧酸取代，所述取代不会影响 本发明中所使用的多核巧酸编码的多肤序列。另外，还可W使用本领域中的已知的方法对 多核巧酸进行修饰，W增强本发明多核巧酸在体内的活性或者存活期。
[0018] 本领域技术人员可W根据遗传密码表，基于SEQIDNO;1所示的氨基酸序列，设 计多种多核巧酸，进而获得氨基酸序列如SEQIDNO;1所示、具有亮氨酸脱氨酶活性的蛋 白质。
[0019] 本发明实例中，所述的基因全长1092bp。将该基因连接在表达载体祀T2化上，构 建重组质粒祀T2化-LeuDH，随后将该重组质粒转化到感受态细胞E.coliBL21 〇)E3)中， 将含有重组质粒祀T2化-LeuDH的大肠杆菌鍊胞转接到含有氨节青霉素的自诱导液体培 养基上进行培养。待0D600皿为1. 0时，进行低温诱导目的基因的表达，诱导结束后采用超 声波破碎细胞，获得具有活性的亮氨酸脱氨酶。用紫外分光光度计分别测定了粗酶液和空 白对照含有质粒祀T2化大肠杆菌表达产物的酶活力。2血反应体系下；P化0.0的NasCOs/ NaHC〇3缓冲液，含lOmMk亮氨酸，3. 5mMNAD+加入50yL的酶液于25°C下检测到340nm处 吸光值的降低，而空白对照检测不到酶活力。证明诱导表达出的亮氨酸脱氨酶具有活性。
[0020] 粗酶液经镶柱亲和层析时，加入酶液后在37°C摇床6虹pm下15min充分结合，再 用WashBuffer洗去杂蛋白后，再用ElutionBuffer将目的蛋白分批次洗脱下来，洗脱之 前每批次在37°C摇床65rpm下15min充分后洗脱。用紫外分光光度计分别测定了己纯化的 酶液，在60°C，P化0. 0条件下，纯酶液的酶活为35. 93IU，比酶活为326. 63U/mg。
[0021] 有益效果；亮氨酸脱氨酶在催化制备氨基酸方面有非常大的优势。本发明提供一 种来自于Laceyellasacchari的亮氨酸脱氨酶，运用基因工程实现其高效表达，提高了亮 氨酸脱氨酶的生产效率，该亮氨酸脱氨酶在70°C水浴1.6小时后，该酶酶活降至原活性的 50% ;而在65°C水浴2. 4小时后，该酶酶活降至原活性的50% ;在60°C下，该酶半衰期达到8 小时。该酶抑耐受范围较广，储存在抑6至11的缓冲中，室温条件下，酶活几乎不发生衰 减。由于其耐热性质较好，抑适应范围较广，在工业生产中能够有效延长半衰期，降低生产 成本。
[0022] 本发明实验实例中对该亮氨酸脱氨酶酶学性质的工作有利于进一步研究亮氨酸 脱氨酶的结构和功能之间的联系。
【附图说明】
[0023] 图1是含有亮氨酸脱氨酶基因的重组质粒祀T2化-LeuDH结构图。
[0024] 图2是含有亮氨酸脱氨酶基因的重组质粒祀T2化-LeuDH的per验证电泳绪果。 其中，marker;MarkerDL2000;1，2:来自不同菌落的祀T2化-LeuDH的per鉴定。
[00巧]图3是诱导表达后粗酶液和纯酶液的SDS-PAGE电泳结果图。其中M:Protein Marker;1:洗脱缓冲液洗脱得到的纯酶；2:重组菌的诱导表达的粗酶经过热处理后的样 品；3:重组菌诱导表达的粗酶。
[0026] 图4是纯酶的最适反应温度实验结果图； 图5是纯酶的最适反应抑实验结果图； 图6是纯酶的热稳定性实验结果图； 图7是纯酶的抑稳定性实验结果图。
【具体实施方式】
[0027]本发明提供了编码具有亮氨酸脱氨酶活性的多肤的多聚核巧酸分子，该核巧酸分 子是从Laceyellasaccharis中分离得到的，具有SEQIDNO. 2的核巧酸序列，它编码364 个氨基酸的多肤，推测分子量为40~42kDa。
[0028] 本发明还设及一种重组载体，该载体包含本发明的核巧酸序