一种果糖基转移酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 发明设及基因工程领域，具体地，本发明设及一种果糖基转移酶FWT01及其编码 基因与应用。
【背景技术】
[0002] 低聚果糖又称寡果糖或庶果S糖族低聚糖，分子式为；G-F-F。，n= 1~3佑为葡 萄糖，F为果糖）。低聚果糖是庶糖分子的果糖残基上通0 -1-2糖巧键连接1~3个果糖 基而形成的果糖寡聚体；庶果=糖、庶果四糖、庶果五糖及其混合物。与传统糖类相比，新型 低聚果糖可作为益生元，促进双歧杆菌的生长、减少有害菌。低聚果糖具有水溶性膳食纤维 的功效，且无任何毒副作用。低聚果糖广泛存在于大麦、西红柿、黑麦等植物中，但其含量较 少（<1%)，开发较难。利用微生物低聚果糖生产酶（果糖基转移酶）可得到高纯度、高产 量的低聚果糖，果糖基转移酶是一种具有果糖基转移活性的酶，能作用于庶糖催化获得庶 果=糖等低聚糖。
[0003] 在果糖转移酶研究方面，目前国内主要集中在野生菌筛选、性质测定等方面。王立 梅等对一株曲霉果糖转移酶酶学性质及底物特异性进行研究，在pH5. 5, 30°C条件下，果糖 基转移酶具有最高活性。郑氏金云等研究了在不同庶糖浓度下从黑曲霉AS0023纯化的转 化酶（INV)和果糖转移酶（FTS)的酶催化活力。在将来的研究过程中，具有优良催化性能 的优良果糖基转移酶基因的挖掘与发现显得尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种催化庶糖生产高纯度低聚果糖的果糖基转移酶、其氨基 酸序列、编码该果糖基转移酶的基因、含有该基因的重组载体、含有该重组载体的重组菌 株、一种制备果糖基转移酶的基因工程方法、该果糖基转移酶的应用。
[000引具体包括；
[0006] 本发明提供了一种果糖基转移酶FWT01，其氨基酸序列如序列1所示。
[0007]序列1 :
[0008]MKLQTASV化GSAAAASPSMQTRASWIDYNVAPP化STLPNGSLFETWRPRAHVLPPNGQIGDPCLHY TDPSTGLFHVGFLHDGSGISSATT孤LATYKDLNQGNQVIVPGGINDPVAVFDGSVIPSGINGLPI'LLYTSVS化PI HWSIPYTRG沈TQSLAVSSDGGSNFTKLDQGPVIPGPPFAYNVTAF畑PYVFQNPTLD化LHSKNNTWYTVISGGLH GKGPAQFLYRQYDPDFQYWEFLGQWWHEPTNSTWGNGTWAGRWAFNFETGNV!^SU)EYGYNPHGQIFSTIGTEGSDQ PVVP化TSIHDMLWVSGNVSRNGSVSFTPNMAG化DWGFSSYAAAGKVUSTSUSTKSGAPDRFISYVWLSGDL巧 QAEGFPTNQQNWTG化LLPRELRVLYIPNVVDNALARESGASWQWSSDSSAGTVELQTLGISIARETKAA化SGTS FTESDRTLNSSGVVPFKRSPWKFFVLSA^SFPASARGSGLKSGFQILSWLESTTVYYQI^SWSnVDRSNTSAA ARTTDGIDSSAEAGKL化抑化NGGEQAIETLDLTLVVDNS化EIYANGRFALSTWVRSWYANSTNISFFQNGVGGV AFSNVTV沈GLYDAWPDRQS
[0009] 其中，该酶基因编码628个氨基酸，其理论分子量为67. 89kDa。
[0010] 本发明提供了编码上述果糖基转移酶的基因FWT-01，具体的，该酶的基因序列如 序列2所不；
[0011] ATGAAGCTTCAAACGGCTTCCGTACTGCTCGGCAGTGCTGCTGCTGCCTCGCCTTCCATGCAGACGCGG GCCTCCGTTGTCATCGACTACAATGTCGCACCTCCAAACCTATCCACTCTGCCCAATGGCTCCCTCTTCGAAACATG GCGTCCCCGCGCCCACGTCCTGCCCCCCAACGGCCAGATCGGTGACCCCTGCCTGCATTACACCGATCCCTCCACGG GCCTCTTCCACGTCGGCTTCCTTCACGATGGCAGCGGCATCTCCAGCGCCACCACTGATGATCTAGCCACCTACAAG GACCTCAACCAAGGCAACCAAGTCATTGTTCCCGGGGGTATCAACGACCCCGTCGCCGTCTTCGATGGCTCCGTCAT CCCCAGCGGCATCAACGGCCTCCCCACTCTCCTCTACACCTCCGTCTCCTTCCTTCCCATCCACTGGTCCATCCCCT ACACCCGCGGCAGTGAGACCCAATCCCTCGCTGTCTCCTCGGATGGCGGCAGCAACTTCACCAAGCTCGACCAGGGC CCCGTCATCCCTGGCCCTCCCTTCGCCTACAACGTCACCGCATTCCGGGACCCCTACGTCTTCCAAAACCCCACCCT CGACTCCCTCCTGCACAGCAAGAACAACACCTGGTATACCGTCATCTCCGGTGGTCTGCACGGCAAGGGCCCCGCCC AGTTCCTCTACCGCCAGTACGACCCGGACTTCCAGTACTGGGAGTTCCTCGGCCAATGGTGGCACGAGCCCACCAAC TCCACTTGGGGTAACGGCACCTGGGCCGGCCGATGGGCCTTCAACTTCGAGACCGGCAACGTCTTCAGTCTCGACGA GTACGGATACAACCCCCACGGCCAGATCTTCTCCACGATCGGCACCGAGGGCTCTGACCAGCCCGTCGTGCCCCAGC TCACCAGCATCCACGACATGCTCTGGGTGTCCGGCAACGTCTCTCGCAATGGCTCTGTCTCGTTCACCCCGAACATG GCGGGCTTCCTCGACTGGGGCTTCTCCTCTTACGCAGCTGCCGGAAAGGTCCTCCCCTCGACTTCTCTGCCCTCGAC GAAGAGCGGCGCCCCGGACCGCTTCATCTCGTACGTCTGGCTGTCCGGTGACCTGTTCGAACAGGCCGAAGGGTTCC CCACGAACCAGCAGAATTGGACCGGTACGCTGTTGCTTCCGCGAGAGTTGCGCGTGCTGTATATCCCCAACGTGGTG GACAATGCTCTGGCTCGGGAATCTGGTGCCTCGTGGCAGGTCGTGAGCAGCGATAGCAGTGCGGGCACCGTCGAGCT GCAGACCCTGGGTATCTCCATTGCCCGGGAAACCAAGGCCGCCCTGCTGTCGGGAACGTCGTTCACCGAGTCCGACC GTACTCTGAACAGCAGTGGTGTCGTGCCGTTCAAGCGCTCCCCGTCCGAGAAGTTCTTTGTTTTGTCCGCGCAGCTG TCCTTCCCTGCTTCGGCTAGGGGATCGGGACTCAAGAGTGGATTCCAGATTCTCTCGTCGGAGCTGGAGAGTACTAC CGTGTACTACCAGTTCTCGAATGAGTCGATTATCGTCGACCGCAGTAACACCAGTGCTGCGGCGCGCACGACGGATG GTATCGATAGCAGCGCGGAGGCTGGCAAGTTGCGCCTGTTTGACGTGTTGAATGGCGGAGAGCAGGCGATTGAGACG TTGGATTTGACTCTCGTGGTGGATAACTCGGTCTTGGAGATCTATGCCAATGGTCGCTTTGCGTTGAGTACTTGGGT TCGTTCTTGGTACGCCAATTCCACGAACATCAGTTTCTTCCAGAATGGCGTGGGTGGTGTTGCGTTCTCCAACGTGA CTGTTTCCGAGGGCTTGTATGATGCTTGGCCGGATCGTCAGTCT
[0012] 本发明通过RT-PCR方法克隆了果糖基转移酶基因FWT-01，DNA全序列分析结果表 明，果糖基转移酶FWT01的编码基因FWT-01全长1884bp。
[0013] 将上述果糖基转移酶基因FWT-01序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进 行BLAST比对，该序列与来源于A.niger的0 -D-快喃果糖巧酶（sucl)序列相似性最高 (98% )，说明FWT01是一种新的果糖基转移酶。
[0014] 对于Ppastoris表达系统，本发明提供了包含上述果糖基转移酶基因FWT-01的 重组载体，如PPIC9K。将本发明的果糖基转移酶基因插入至表达载体相应的限制酶切位 点，使其核巧酸序列与表达调控序列相连接，作为本发明的一个最优选实验方案，优选果糖 基转移酶基因插入到质粒PPIC9K，使该核巧酸序列位于A0X1启动子的下游并受其调控，得 到重组P.pastoris表达质粒PPIC9K-FWT-01。本发明还提供了包含上述果糖基