一种提高绵羊产羔数多基因聚合早期选种的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于绵羊分子育种技术领域，具体设及一种提高绵羊产黑数多基因聚合早 期选种的方法，本发明通过克隆得到与绵羊产黑数性状相关的分子标记。通过将所述的分 子标记组合使用提高绵羊产黑数多基因聚合早期选种中的应用。所述的分子标记从化cB、 BMP15和FS皿基因中克隆得到。
【背景技术】
[000引根据FA0(2012)的统计数据，我国现有绵羊1.87亿只，占世界饲养量（11. 69亿 只）的16%，居世界首位化ttp://www.化0.org/home/en/)，是最大的羊肉生产和消费国。 但我国养羊业整体生产水平与国外发达国家仍有一定的差距。自1970年W来，养羊业发达 国家逐步建立和形成了较为完善的肉羊繁育体系，在广泛应用经济杂交的基础上培育专口 化早熟肉用和适于黑羊肉生产的新品种，具有产黑率较高、泌乳性能好、黑羊生长发育快、 肉用性能好、饲料报酬高等优点。我国肉羊育种工作落后于发达国家，与生产的实际需求差 距巨大。主要用引入品种与本地品种杂交进行杂交育种，选育的技术和方法不先进，尚未培 育出拥有自主知识产权的优质肉羊品种。
[0003] 绵羊的群体遗传改良对保障羊肉供给，促进国民经济发展和提高人们生活水平具 有重要意义。绵羊的繁殖性状，尤其产黑数是现代养羊生产中最重要的经济性状之一。而 我国绵羊群体的繁殖性能总体仍然比较低，在舍饲养羊比重不断增大的大背景下，繁殖性 能和产肉性能的遗传改良是当前乃至今后一段时间内我国绵羊群体遗传改良的重点，而繁 殖性能遗传改良的重点应放在产黑数性状上。繁殖性状属阔性状，是一种低遗传力（平均 0.1)的性状，并且在不同环境和不同饲养条件下产黑数也受到一定影响，因此常规育种方 法遗传改良进展缓慢，亟需人们加深对繁殖性状遗传机制的了解，W促进绵羊繁殖性状的 遗传改良。随着现代分子生物技术的发展，分子标记已在绵羊生产中广泛应用，并取得了一 定成绩。然而繁殖性状受微效多基因控制，而且为加性-显性基因作用模式，单分子标记的 选择并不能充分挖掘高繁殖力个体的遗传潜能，同时也会影响选种的准确性。多基因聚合 育种技术可将对目标性状的多个有利基因型聚合到同一个基因组中，其技术优势在于可提 高选择的准确性，加大选择强度，培育出目标性状突出、育种应用价值高的优势种群。
[0004] 对于绵羊繁殖性状候选基因的研究，最早且作用机制相对最清楚的是化cB基因， 它是于1980年由Davis在Booroola绵羊的常染色体上发现的，具有提高排卵率和产黑 数等生物学作用值avisGH等，Segregationofamajorgeneinfluencingfecundity inprogenyofBooroolasheep.NZJAgricRes, 1982, 25:525-529 ;C.J.H.Souza 等，SecretionofInhibinAandFollicularDynamicsthroughouttheEstrous CycleintheSheepwithandwithouttheBooroolaGene(FecB).Endocrinolo gy, 1997, 138(12) :5333-5340)。之后，Mulsant等和Wilson等几乎同时报道了将化cB基 因定位于绵羊6号染色体6q23-31，并发现该基因是由于BMPR-IB基因高度保守的胞内激 酶信号区域一个突变（Q249R)的结果（WilsonT等，Hi曲lyprolificBooroolasheep haveamutationintheintracellular(ALK-6)thatisexpressedinbothoocyte sandgranulosacells.Biol民eprod, 2001，1225-1235;MulsantP等，Mutationinbone morphogeneticproteinreceptor-IBisassociatedwithincreasedovulationrate inBooroolaMerinoewes.ProcNatlAcadSciUSA, 2001，98:5104-5109)。Souza等 将Booroola羊与普通绵羊的cDNA进行比对时发现830bp处有一个A〉C突变，使BMPR-IB 的胞内信号区第249位氨基酸由Glu变成Arg伯249R)，从而导致Booroola母羊出现 超多产黑数基因型（SouzaCJ等，化6Booroola^ecB)Phenotypeisassoeiated withamutationinthebonemorphogeneticreceptortypeIB(BMP民一IB)gene.J Endoerinol, 2001，169 (2) : 1-6)。
[0005]绵羊骨形态发生蛋白 15 化onemoi'phogeneticprotein15,BMP15)基因是 影响产黑数的主效基因么一（GallowaySM等，Mutationsinanoocyte-derived growthfactorgene(BMP15)causeincreasedovulationrateandinfertilityin adosage-sensitivemanner.NatGenet, 2000, 25 (3) : 279-283)。该基因BMP15 基因有 2个外显子和1个内含子，夕h显子1长324bp，外显子2长855bp，中间隔着5400bp的内 含子，编码393个氨基酸残基前蛋白，其成熟活性版为125个氨基酸（HanrahanJP等， Mutationsinthegenesforoocyte-derivedgrowthfactorsGDF9andBMPlSare associatedwithbothincreasedovulationrateandsterilityinCambridgeand Belcareshe邱?BiolR邱rod, 2004, 70:900-909)。1991 年首先在Romney羊上发现的 BMP15被称为GDF_9B(grow化differentiationfactor9B)，是TGF(化ansforminggrow化 factor)家族成员么一，位于绵羊X染色体上，在卵巢内仅在卵母细胞中特异性表达，其编 码产物在卵母细胞发育过程中起着重要作用化avisDH等，Evidencefor化epresence ofamajorgeneinfluencingovulationrateontheXchromosomeofsheep.Biol 民epord. 1991,44(4) :620-624)。BMP15是由卵母细胞分泌的生长因子，对早期卵泡的生 长和分化起着重要的调节作用QuengelJL等，Effectsofimmunizationagainst bonemorphogeneticprotein15andgrowthdifferentiationfactor9anovulation rate,fertilization,andpregnancyinewes.Biol民eprod, 2004,70(3):557-561)dBMP15 基因编码区外显子II第718bp处发生了C一T突变，这一突变在卵巢内通过使颗粒细胞早 熟及卵泡体积变小增加排卵数，是造成产黑数增加的一个重要基因。
[0006]FSHR(促卵泡素受体）属G蛋白偶联受体超家族中的糖蛋白亚家族成员，由 胞外区、跨膜区和C-末端区构成。它包括至少10个亮氨酸丰富的重复单位（LPR)， 每个约有24个氨基酸残基。与F細产生特异性结合的位点位于LPR5-LPR10么 间；7个a螺旋构成的跨膜结构是G蛋白偶联受体家族的特征性基序。FSHR基因 的cDNA于 1990 年首次被克隆（SprengelR等，化6testicularreceptorfor follicle-stimulatinghormone:structureandfunctionalexpressionofcloned cDNA.MolEndocrinol, 1990, 4 (4) : 525-530)，FSHR突变对生殖表型具有深刻的影响 (AittomakiK等，Mutationinthefolliclestimulatinghormonereceptorgenecauses hereditaryhypergonadotropicovarianfailure.Cell, 1995, 82 (6) : 959-968)。FSH民在 动物繁殖活动中具有传递促卵泡生长发育生物学信息的作用，其基因突变可能增强或削 弱转导F細信息的功能，对生殖表型具有深刻的影响。人的FSHR基因位于2号染色体短 臂2区1带，包括10个外显子和9个内含子(Gmmol1J等，Localizationofthehuman FSHreceptortochromosome2p21usingagenomicprobecomprisingexonlO,Mol. EndocrinoL, 1994(12):265-271 ;Rousseau_Merck等，Thechromosomallocalizationof thehumanfollicle-stimulatinghormonereceptorgeneon2p21-pl6issimilar tothatoftheluteinizinghormonereceptorgene,Genomics, 1993(15):222-224)。 SatokoSudo等（2002)用PCR-SSCP分析FS皿基因多态性，检测其基因型频率，研究表明 激素水平及一些妇科病与FSHR基因多态性相关。国内在二花脸猪上检测到了FSHR基因座 位的多态性，研究结果表明，在FS皿基因座位发现的该个PCR-SSCP标记与二花脸