9种植物微小核糖核苷酸及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体设及9种植物微小核糖核巧酸及其应用。
【背景技术】
[0002] 微小核糖核酸（MciroRNA，miRNA)是一类特殊的非编码单链小分子RNA，由19~25 个核巧酸组成，是近10年来生物学研究的热点。大量研究证实，动物体内的miRNA可通过 抑制祀mRNA翻译而降低相应蛋白合成，广泛参与细胞活动的一系列生理及病理活动过程， 包括细胞发育、细胞调亡、细胞代谢、肿瘤形成、病毒感染及免疫应答等。miRNA作为调控细 胞功能的关键因子，其与人体疾病的发生发展密切相关。当生物体体内Dicer酶缺失或不 足时，内源性miRNA无法正常生成，从而导致干细胞的丢失和细胞周期的改变、早期胚胎 体致死和器官发育异常。因此，miRNA可作为疾病早期诊断及预后的生物标志物，亦可作为 药物干预的新祀点和新途径。
[0003] 由于miRNA不仅在基因位置上保守，序列上也呈现出高度的同源性。一些植物内 源性的核巧酸类物质通过日常饮食吸收进入体内后，可被体内的Dicer酶剪切，产生一类 类似于miRNA的核巧酸类物质，进而影响人体mRNA的表达。近年来，植物miRNA被证实是 一类新的药效物质，可跨界调控人体基因大豆、玉米(根、叶及种子)、大要中的一些miRNA均 可W通过日常饮食吸收进入血内，并具有一定的组织分布选择性。牛奶中也含有大量的具 有免疫调控功能的miRNA。相对于动物来源的miRNA,植物来源的miRNA由于其基因编码末 端本身是2-0-甲基化修饰的，其化学结构更为稳定，即使采用高舰酸钢、福尔马林等强氧 化剂、强腐蚀剂进行处理，其结构亦不产生影响；即使经过了高温蒸煮、消化系统的代谢等 过程，植物来源miRNA的结构依然没有发生变化，不被降解，仍然可W在血液中检出，在种 间的"穿梭"仍能保持稳定的状态，表明了植物miRNA结构的高度稳定性。
[0004] 由此我们推测，miRNA也可能是中药的活性成分之一，并且不同于W往中药或中药 活性成分进入人体调节其他分子的作用机制，中药miRNA可W直接调节人体mRNA表达。因 此，利用miRNA技术多个视角探讨研究中医药具有广阔的前景。为了验证该些检测到的植 物miRNA序列的确来源于植物，对人/小鼠血清的totalRNA进行高舰酸钢处理，对人/小 鼠血清中检测到的几个植物miRNA进行miRNA测序和qPCR鉴定。由于高舰酸钢为强氧化 剂，能够氧化动物来源的miRNA的2'、3'位自由哲基，导致动物来源的miRNA在进行miRNA 测序和qPCR时不被检测到或者检测丰极低。植物来源的miRNA由于其末端本身是2-0-甲 基化修饰的，高舰酸钢处理对对其结构不产生影响，所W在进行miRNA测序和qPCR时其检 测表达量几乎不产生变化。从而证明几个miRNA的确来源于植物。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供9种来源于植物的治疗肿 瘤和非酒精性脂肪肝疾病的microRNA及其应用的技术方案。
[0006] 所述的用于制备治疗肿瘤和非酒精性脂肪肝疾病的药物，其特征在于包含9种 植物microRNA的任一种，所述的9种植物microRNA分别为csi-miR3952、csi-miR48化、gma-miR393a、csi-miR482c、gma-miR396a、gma-miR159a、csi-miR172a、csi-miR530a、 cca-miR167。
[0007] 所述的用于制备治疗肿瘤、非酒精性脂肪肝疾病的药物，其特征在于9种植 物microRNA的RNA包含如下序列；csi-miR3952核巧酸序列如SEQIDN0;1所示， csi-miR48化核巧酸序列如SEQIDN0;2所示，gma-miR393a核巧酸序列如SEQIDN0;3所 示，csi-miR482c核巧酸序列如SEQIDNO;4所示，gma-miR396a核巧酸序列如SEQIDNO; 5所示，gma-miR159a核巧酸序列如SEQIDNO;6所示，csi-miR172a核巧酸序列如SEQID NO;7所示，csi-mi贴30a核巧酸序列如SEQIDNO;8所示，cca-miR167核巧酸序列如SEQ IDNO;9 所示。
[0008] 所述的用于制备治疗肿瘤、非酒精性脂肪肝疾病的药物，其特征在于9种植物 microRNA的前体RNA包含如下序列；csi-miR3952前体核巧酸序列如SEQIDN0;10所示， csi-miR48化前体核巧酸序列如SEQIDNO;11所示，gma-miR393a前体核巧酸序列如SEQ IDNO;12所示，csi-miR482c前体核巧酸序列如SEQIDNO;13所示，gma-miR396a前体 核巧酸序列如SEQIDN0;14所示，gma-miR159a前体核巧酸序列如SEQIDN0;15所示， csi-miR172a前体核巧酸序列如SEQID^;16所示，〇31-1111贴3〇3前体核巧酸序列如569 IDNO;17所示，cca-miR167前体核巧酸序列如SEQIDNO;18所示。
[0009] 所述的9种植物microRNA中任一种或几种在制备治疗肿瘤、非酒精性脂肪肝 疾病的药物中的应用，所述的9种植物microRNA分别为csi-miR3952、csi-miR482b、 gma-miR393a、csi-miR482c、gma-miR396a、gma-miR159a、csi-miR172a、csi-miR530a、 cca-miR167。
[0010] 所述的应用，其特征在于9种植物microRNA的RNA包含如下序列；csi-miR3952 核巧酸序列如SEQIDNO; 1所示，csi-miR482b核巧酸序列如SEQIDNO;2所示， gma-miR393a核巧酸序列如SEQIDN0;3所示，csi-miR482c核巧酸序列如SEQIDN0;4所 示，gma-miR396a核巧酸序列如SEQIDN0;5所示，gma-miR159a核巧酸序列如SEQIDNO; 6所示，csi-miR172a核巧酸序列如SEQIDNO;7所示，csi-mi贴30a核巧酸序列如SEQID NO;8所示，cca-miR167核巧酸序列如SEQIDNO;9所示。
[0011] 所述的应用，其特征在于9种植物microRNA的前体RNA包含如下序列； csi-miR3952前体核巧酸序列如SEQIDN0;10所示，csi-miR48化前体核巧酸序列如SEQ IDNO;11所示，gma-miR393a前体核巧酸序列如SEQIDNO;12所示，csi-miR482c前体 核巧酸序列如SEQIDN0;13所示，gma-miR396a前体核巧酸序列如SEQIDN0;14所示， gma-miR159a前体核巧酸序列如SEQIDN0;15所示，csi-miR172a前体核巧酸序列如SEQ 10側；16所示，。31-1111贴3〇3前体核巧酸序列如569 10側；17所示，。。3-11111?167前体核巧 酸序列如SEQIDNO; 18所示。
[0012] 本发明一方面提供了一种治疗肿瘤和非酒精性脂肪肝疾病的药物，该药物具有抗 肿瘤细胞增殖，改善肝脏脂肪积聚，本发明另一方面确定了一种治疗肿瘤和非酒精性脂肪 肝疾病的药物的应用，其可作为治疗肺癌、结肠癌、非酒精性脂肪肝炎。
【附图说明】
[0013] 图1miRNA抑制化pG2细胞脂肪变性。
【具体实施方式】
[0014] W下结合实施例来进一步说明本发明。
[0015] 实施例1 ;miRNA的筛选及鉴定 选择新鲜或阴干的枯皮，分别用于喂食小鼠和miRNA测序（3个生物学重复)。两组ICR小鼠（18~20g)，共计6只，分别禁食8h后，对照组禁食不禁水，实验组灌食枯皮匀浆液。 于给药2h后采集相应小鼠血液，分离血浆，分别提取totalRNA。质检合格后制备文库，采 用IlluminaHiseq2000进行样本测序分析。根据测序结果，选择在枯皮miRNA测序中发现 并有较高表达丰度，在喂食小鼠饲料的小鼠血浆miRNA测序中未发现，在灌食枯皮组的小 鼠血浆miRNA测序中发现并有较高表达丰度的miRNA,该些miRNA作为植物来源的miRNA在 小鼠体内发挥生物学功能的可能性很大。对于该些植物来源的miRNA(选择10-15个表达 丰度相对高的)，通过qPCR分别在小鼠灌食枯皮的血浆miRNA和枯皮miRNA进行鉴定。最终 选择csi-miR3952、csi-miR482b、gma-miR393a、csi-miR482c、gma-miR396a、gma-miR159a、 csi-miR172a、csi-mi贴30a、cca-miR167为枯皮中存在的，并可吸收入血的miRNA。比较其 表达量在喂食枯皮小鼠血浆中随着时间变化的趋势，基本判定该些miRNA是来自于枯皮。
[0016] 实施例2;抗肿瘤药效试验 1.体外抗肿瘤实验 1.1对肿瘤细胞增殖的影响 取培养3~4d处于指数生长期的培养细胞一瓶，加入适量的0. 25%T巧psin-邸TA液， 使贴壁细胞脱落，用10%胚牛血清的RPMI1640培养基配成1X104个细胞/ml悬液。取96 孔平板，每孔加细胞悬液100yL置371：、5%C02及100%湿度培养箱中培养2化后，每孔加入 不同浓度的通过化学方法合成的csi-miR3952、csi-miR482b、gma-miR393a、csi-miR482c、 gma-miR396a、gma-miR159a、csi-miR172a、csi-mi贴30a、cca-miR167 (csi_miR3952 核巧 酸序列如SEQIDNO;1所示，csi-miR48化核巧酸序列如SEQIDNO;2所示，gma-miR393a 核巧