调控柑橘果皮脱绿的关键乙烯响应因子及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，设及一个调控巧橘果皮脱绿的关 键己締响应因子（CUERF13,SEQ;N0. 1)，W及在植物颜色修饰的基因工程育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 巧橘属于芸香科（Rutaceae)巧橘亚科（Aurantioideae)，分为积属（Poncirus Raf)、金巧属（FortnoellaSwing)、巧枯属（CitrusL.)，是世界第一大果树品种，其种植面 积和产量均居首位，也是我国原产水果之一。巧橘果肉风味独特且具有抗癌和抗肿瘤等功 能，而果皮富含芳香物质和天然色素（叶绿素和类胡萝h素)。叶绿素不仅影响果实的光合 作用，而且在果实呈色中起主要作用。在众多巧橘品种中，有些在果实发育过程中逐渐降解 果皮中叶绿素含量，使果实色泽由绿色转变为黄色，例如纽荷尔厮澄；而有些巧橘品种的果 皮叶绿素降解则在果实采收后，例如椎巧。椎巧果实常在绿熟期被采收，为促使果实外观着 色均匀，提高椎巧果实的商品性，商业上常用己締烟熏法或己締利浸薩法促进其果皮叶绿 素的降解。
[0003] 己締是一种重要的植物激素，参与植物生长的整个过程，包括种子萌发、花的发育 与分化、果实的成熟与衰老等过程，同时己締也是一种信号物质，响应生物与非生物逆境胁 迫。己締响应因子（ERF)位于己締信号转导途径的末端，其序列中含有一个AP2/ERF结构 域，可转录调控各种己締响应的目标基因，如细胞壁形成和果实成熟衰老相关的基因，进而 产生广泛的己締生物学效应。但是在巧橘果皮脱绿过程中，ERFs家族成员调控叶绿素降解 的生物学机制尚不清楚。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一个调控巧橘果皮脱绿的关键己締响应因子（CUERF13)，其 核巧酸序列如SEQ;N0. 1所示。
[0005] 本发明的另一个目的是提供所述的响应因子（CUERF13)在植物颜色修饰的基因 工程育种中的应用，尤其在调控巧橘果皮脱绿中的应用。研究表明，本发明提供的巧橘己締 响应因子Ci巧RF13(SEQ;N0. 1)可调控叶绿素降解，因此可应用到植物颜色修饰的基因工 程育种中。
[0006] 本发明提供的响应因子（CitERF13)的特征功能如下； 1.基因序列特征 Ci巧RF13 (SEQ;N0. 1)含有一个保守的AP2/ERF结构域，属于ERF转录因子家族。在Ci巧RF13的氨基酸序列中还含有化t4 (服服)核定位信号，说明其在细胞中定位细胞核内。
[0007] 2.基因表达特征 在纽荷尔厮澄果实发育过程中，叶绿素不断降解，然而Ci巧RF13的表达高峰先于果皮 中叶绿素的降解。
[000引与空气处理相比，经己締处理的采后椎巧果实，48h后巧橘色泽指数（CCI)明显上 升，而叶绿素含量则显著降低。与之一致的是，CUERF13的表达受到外源己締的显著增强， 且在处理4h时即出现表达高峰，先于果皮叶绿素的降解。
[0009] 上述基因表达结果说明Ci巧RF13参与了巧橘果皮叶绿素的降解过程，可调控巧 橘果皮的脱绿。
[0010] 3.基因功能特征 Ci巧RF13(SEQ;N0. 1)在纽荷尔厮澄果皮中瞬时过量表达时，可促进其叶绿素的降解， 加快果皮脱绿。Ci巧RF13的该一功能可应用于修饰植物色泽的基因工程育种中，且具有类 似功能的基因未曾有报道。
[0011] 本发明利用巧橘基因组数据库（http://www.citrusgenome化.org)信息，结合纽 荷尔厮澄发育阶段和椎巧采后己締处理材料中ERF基因表达量的变化，W及在巧橘果皮中 瞬时过量表达的表型，克隆并鉴定出1个与巧橘果皮脱绿相关的邸F基因Ci巧RF13(SEQ: NO. 1)，可调控叶绿素降解，可应用到植物颜色修饰的基因工程育种中，本发明为进一步研 究其作用机制和果皮着色技术提供理论依据。
【附图说明】
[0012] 图1是纽荷尔厮澄发育阶段CCI和叶绿素含量变化（A)、Ci巧RF13(SEQ;N0. 1) 在其发育过程中表达模式（B)W及Ci巧RF8(SEQ;N0. 2)在其发育过程中表达模式（C)。 LSD代表最小显著差异法。
[0013] 图2是椎巧采后己締处理CCI(A)、叶绿素含量变化（B)、Ci巧RF13(SEQ;N0. 1) 在其处理下的表达模式（C)w及Ci巧RF8(SEQ;N0. 2)在其处理下表达模式（D)。LSD代 表最小显著差异法。
[0014] 图3是Ci巧RF13(SEQ;N0. 1)在纽荷尔厮澄果皮中过量表达表型（A)、CCI(B) 化及叶绿素含量变化（C)。冲<0.05。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合附图和具体实施例，W不具有调控巧橘果皮脱绿的Ci巧RF8(SEQ;N0. 2)，W及Ci巧RF13(SEQ;N0. 1)为例，对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保 护范围。
[0016] 下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》（第=版)。
[0017] 实施例1;基因克隆 基于巧橘甜澄和克林曼了基因组数据库（http://www.citrusgenome化.org)获得CUAP2/ERF基因家族成员。一方面直接根据注释下载可能属于AP2/ERF的基因，另一方面 通过已报道的拟南芥AP2/ERF基因进行BLAST(TBLASTN和BLASTP)分析，将该两种方式所获 得的序列利用AP2/ERF保守结构域进行一一筛选，再用CAP3序列装配程序（http://pbil. univ-lyonl.fr/cap3.地P)去除重复序列，获得Ci巧RF13 (SEQ;N0. 1)和Ci巧RF8(SEQ; NO. 2)。
[001引 结合引物对SEQ;N0. 3 和SEQ;N0. 4,及SEQ;N0. 5 和SEQ;N0.6,利用PCR技 术，分别扩增所得两个基因，其中30ylPCR体系为；10XBuffer3yl，dNTP2.4yl，上 / 下游引物各 0.6yl，酶 0. 15yl，DEPC-H2021.3yl，50mMM拆04l.2yl，cDNA0.75 yl;PCR程序为；95 °C预变性 5min;95 °C变性 30sec，58 °C退火 30sec，72 °C延伸 1 111血35个热循环；72 1：延伸10 111111，4 1：保存。？0?产物采用测序手段（11^1化0肖日11)进一 步验证。
[0019] 实施例2;基因表达分析 (一）实验方法 1.果实材料收集 发育阶段的纽荷尔厮澄果实分别采收于盛花期后90、105、120、135、150、165和180天， 每次取9个果，分为3个生物学重复。
[0020] 盛花期后160天的椎巧果实采后当天抵运实验室，挑选大小均匀，成熟度相对一 致的果实开展试验。将果实随机分成两组(每组100个)，每组平均放置于3个密闭容器，一 组通40化?。己締气体12h，而另一组通空气12h，然后转货架放置于20 °C环境。两 组果实分别于处理0,4,8,12和48h取样。每次取9个果实，分为3个生物学重复。
[0021] 2.巧橘果皮色泽指数（CCI)的测定；采用色差计MiniScanXEPlus(化nterL油， 美国）测定，计算公式为CCI= 1000XaVXlA
[0022] 3.叶绿素含量测定：叶绿素提取采用80 %丙酬分S次抽提，每次抽提后于4 °C， 12000Xg离屯、5分钟吸取上清液，最后定容至10ml体积，用分光光度计测定其663nm和 645nm吸光度值，计算公式为；Chia(mg/ml)= 9. 78XAges- 0. 99XAe4日;化1b(mg/ 血)=21. 4XAe45- 4. 65XA邸3。
[0023] 4.RNA提取；巧橘果皮切成了后迅速用液氮冷冻，保存于-80 °C备用。提取RNA 时，称取Ig冻样加液氮充分研磨后，加入到有4ml65 °C预热的CTAB/e-琉基己醇提取 缓冲液的离屯、管中，祸旋混合使细胞彻底破裂，65 °C加热3-5min;然后向离屯、管中加入4 ml氯仿；异戊醇（24; 1)抽提液，充分祸旋混合；15°C10000巧m离屯、10min,吸取上清液 到新的离屯、管，重新抽提一次；得到的上清液小屯、吸取到新的离屯、管中，加入1/4体积的10 moVl的LiCl，4 °C放置过夜；第二天，4°C10000巧m离屯、20min,倒掉上清液，将离屯、管 倒置于纸巾上W去除多余的溶液；加入400 65°CSSTE，溶解沉淀；再加入400 氯 仿；异戊醇（24 ;1)抽提液，祸旋混合；将液体彻底吸入1. 5ml离屯、管中20°C10000巧m离屯、10min,吸上清液到新的离屯、管中加入2倍体积的-20°C预冷的无水己醇，上下颠倒 混匀，-80 °C放置30minW上；4°C10000巧m离屯、25min,倒掉上清液，短暂离屯、后吸 出残余液体，将沉淀在通风榻惊干(约5-10min);每管加入20y1DEPC水溶解沉淀，得到 总RNA样品；用1 %琼脂糖凝胶电泳检测所得样品完整性，结果显示样品有两条带，亮度为 上条；下条=2 ;1，说明RNA样品完整无降解；用紫外分光光度计检测所得样品纯度，吸取1 y1RNA样品用49y1DEPC水稀释后，检测0〇2日。和0D28。，分析得到〇〇2日。/〇〇28。=1. 8-2. 0,说 明RNA纯度符合标准。根据公式0D2wX40 (RNA浓度系数）X50 (样品稀释倍数)即可计算 出样品RNA的浓度（ng/y1)，进行下一步研究。
[0024] 5.cDNA合成 提取的总RNA采用TURBO面aseKiUAmbion，美国)去除基因组DNA污染，取1. 0yg RNA按iScriptcDNASynthesisKit(Bio-Rad,美国）逆转录成cDNA。
[00巧]6. 基因表达分析：使用Primer3在线软件化ttp://f;rodo.wi.mit.edu/primer3/)设计