一种类芽孢杆菌细菌素粗提物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种类芽抱杆菌细菌素粗提物及其制备方法 和应用。
【背景技术】
[0002] 细菌素是某些细菌产生的具有抗菌活性的物质，主要成分为多肤、蛋白质或蛋白 质复合物，最早由化cob于1953年提出。近年来，广谱抗生素的普及甚至滥用所带来的负面 效应日益突出，新型抗生素替代品的研究迫在眉睫。作为蛋白质类物质的细菌素，由于可被 蛋白酶降解，其安全性很高，故受到越来越多的关注。尽管目前开发获得的细菌素（Nisin) 已具备了极高的防腐与抑菌的应用价值，但受Nisin本身的特性（低抑条件下性质稳定， pH〉7. 0抑菌活性逐渐丧失）的影响，其应用的范围受到了极大的局限性，其次，目前细菌素 的获得都来自化学合成培养基，此类培养基成分多样，配方复杂，配制过程繁琐具有潜在食 品安全风险，再者，制备细菌素的成本非常高、细菌素的来源相对有限，上述问题很大程度 上限制了细菌素的开发和利用。
【发明内容】
[0003] 因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有细菌素稳定性差，制备成本高，来源 不足，发酵培养基成分多样，配方复杂，配制过程繁琐且具有存在潜在的食品安全风险的现 状，提供了一种类芽抱杆菌细菌素粗提物及其制备方法和应用。
[0004] 本发明人发现类芽抱杆菌（Paenibacillussp.)CGMCCNo. 8333菌株经款皮培养 基发酵后所得上清，通过硫酸锭盐析、离屯、得到的沉淀复溶后，经透析、冷冻干燥可获得具 有强烈抑菌活性的类芽抱杆菌粗提物，从而完成了本发明。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为；一种类芽抱杆菌细菌素粗 提物的制备方法，所述制备方法包括W下步骤：
[0006] (1)将类芽抱杆菌（PaenibacillusSP.)接种于培养类芽抱杆菌的培养基中，震 荡发酵培养获得发酵液，将所得发酵液离屯、取上清液；
[0007] (2)向步骤（1)所得上清液中加入硫酸锭，离屯、收集硫酸锭饱和度为30~70%时 析出的沉淀，将所得沉淀溶解后透析，冷冻干燥，即得。
[000引其中步骤（1)将类芽抱杆菌（Paenibacillussp.)接种于培养类芽抱杆菌的培 养基中，震荡发酵培养获得发酵液，将所得发酵液离屯、取上清液。其中所述类芽抱杆菌 (Paenibacillussp.)为本领域常规的类芽抱杆菌，较佳地为发酵产生细菌素的类芽抱杆 菌，更佳地为类芽抱杆菌（Paenibacillussp.)，其保藏编号为CGMCCNo. 8333。所述类芽 抱杆菌为现有技术，其制备方法为本领域常规制备方法，或者通过从保藏中屯、购买获得。
[0009] 其中所述养类芽抱杆菌的培养基为本领域常规的培养基，所述培养基较佳地为款 皮培养基，更佳地为小麦款皮培养基，所述款皮培养基的制备方法为本领域常规的制备方 法。所述款皮培养基的配方较佳包括款皮和水，其中款皮的含量较佳地为1~5%，更佳地 为3%，余量为水，所述百分比为质量百分比。
[0010] 其中所述类芽抱杆菌的接种量较佳地为1~5%，更佳地为2~4%，最优地为 3%，所述百分比为体积百分比，所述类芽抱杆菌的发酵温度较佳地为25~37°C，更佳地为 28°C~35°C，最佳地为30°C，所述发酵的时间较佳地为48~96小时，更佳地为60~78小 时，最佳地为72小时，所述震荡发酵培养的速度较佳地为100~3(K)巧m，更佳地为150~ 200;rpm，最佳地为180巧m。
[0011] 本发明所述的发酵方法将所述类芽抱杆菌CGMCCNo. 8333接种于培养基之前，较 佳地还包括该类芽抱杆菌CGMCCNo. 8333活化获得类芽抱杆菌种子的步骤。所述步骤较 佳地包括W下步骤：将本发明所述类芽抱杆菌CGMCCNo. 8333接种在TYC固体培养基中， 25~30°C培养18~28小时即得类芽抱杆菌CGMCCNo. 8333种子；将所得类芽抱杆菌CGMCC No. 8333种子的菌落均匀分散于TYC液体培养基内，再按2%~5%体积百分比的接种量接 种于TYC液体培养基中震荡培养，摇床转速为100~2(K)巧m，培养18-28小时，将所得培养 物离屯、弃去上清，所得菌体用无菌蒸馈水洗漆后，用原培养体积的无菌蒸馈水悬浮，即得发 酵用的类芽抱杆菌的种子。
[0012] 其中步骤（2)为向步骤（1)所得上清液中加入硫酸锭，离屯、收集硫酸锭饱和度为 30~70%时析出的沉淀，将所得沉淀溶解后透析，冷冻干燥，即得。
[0013] 其中所述硫酸锭饱和度较佳地为30~70%，更佳地为40~60%，离屯、的速度较 佳地为8, 000~15,OOOg，更佳地为10, 000~12,OOOg，离屯、的时间较佳地为5~15分钟， 更佳地为8~10分钟，离屯、的温度较佳地为4°C~8°C，更佳地为5°C~rC，所述透析使 用的透析膜的截留分子量较佳地为800化~1200化，更佳地为1000化，透析时间较佳地为 1~3天，更佳地为2天，其中所述溶解的溶剂较佳地为水，更佳地为蒸馈水。在透析过程中 较佳地还包括换水步骤，换水的次数较佳地为2~4次/天。当所述离屯、的条件或者透析 条件的技术参数值在本发明请求保护范围之外时，会使所得类芽抱杆菌细菌素粗提物的抑 菌活性产生显著降低。
[0014]其中所述冷冻干燥为本领域常规的冻干技术，只要能将溶剂去除，获得具有抑菌 活性的类芽抱杆菌细菌素粗提物即可。
[0015] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二为；如本发明所述制备方法所 得类芽抱杆菌细菌素粗提物。
[0016] 本发明所述类芽抱杆菌细菌素粗提物的制备方法中各步骤所述技术特征的优选 范围与上文所述制备方法中相应的技术内容完全一致，具体请参见上文所述技术内容，此 处不再寶述。
[0017] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之=为；如本发明所述类芽抱杆菌 细菌素粗提物在制备功能性食品中的应用。
[0018] 本发明所述类芽抱杆菌细菌素粗提物可W广泛应用于制备各种食品防腐剂，功能 性食品或者功能性饲料中。所述应用较佳地为在制备食品防腐剂中的应用。
[0019] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0020] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0021] 本发明的积极进步效果在于：
[0022] 1、本发明解决了当前细菌素来源狭齡的现状，开创性地将类芽抱杆菌应用于细菌 素的制备工艺。
[0023] 2、目前细菌素的制备都依赖于化学合成培养基，而运用款皮培养基制备细菌素的 研究尚未报道过，本发明首次将款皮培养基作为一种天然的发酵培养基应用于细菌素的制 备，因而其产物具有更高的食品安全性。
[0024] 3、本发明所述用于制备细菌素粗提物的原料为款皮，其来源广、成本低，发酵菌种 为类芽抱杆菌单一菌种，上述组合有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控 制。
[0025] 4、款皮是一种小麦加工的副产品，因此，W其为基料发酵制备的细菌素比常规方 法采用的化学合成培养基具有更高的食品安全性。
[0026] 5、与传统细菌素Nisin相比，采用本发明制备的细菌素粗提物性质更稳定，尤其 在中性条件下抑菌活性显著高于Nisin，因此，具有比Nisin更优的应用价值。
[0027] 6、采用本发明制备的细菌素粗提物可W直接用于食品的生产，从而达到抑制腐败 菌的增殖，延长食品货架期的目的，进而降低了应用的成本。
【具体实施方式】
[002引下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并