检测Leber病线粒体T3394C试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物技术领域，设及用于检测与Leber病相关的线粒体DNAT3394C突变 的试剂盒，还设及一种与Leber病相关的线粒体基因突变的检测方法，特别设及检测线粒 体MVT3394C突变的方法，W及上述方法或上述的试剂盒在检测与Leber病相关的线粒体 DNAT3394C突变中的应用。
【背景技术】
[0002] Leber遗传性视神经病变化eber'SHereditaryOpticNeuropathy,LH0N，简称 Leber氏病）是一种母系遗传性视神经病变，主要累及视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束 纤维，导致视神经退行性变的母系遗传病，严重的影响着人们正常的生产、生活。根据国家 卫生部（http://www.moh.gov.cn/)最新数据统计我国现有的低视力人口约有710万，盲人 约有500万，占总人数的0. 4%，成为世界上视力损伤最严重的国家之一。其中，由视神经病 变引起的约为55万。1871年德国眼科医生化eodorLeber首次报道该病的临床症状、体征 和遗传特性。1972年化ickson等发现LH0N的遗传方式呈典型的母系遗传特征。1988年 WallaceDC等发现了第一个与LH0N相关的线粒体基因组DNA(mitochon化iaDNA,mtDNA) 突变位点MWG11778A。目前已报道50多种线粒体DNA突变位点与LHON致病相关化ttp:// WWW.mitomap.org/)，其中90%W上的LH0N的家系是由氧化磯酸化复合物I亚基上的ND4 G11778A、ND1G3460A和ND6T14484C该3个原发突变位点所致。为了进一步探究LH0N的 发病机制，在全国范围内收集了大量的L册N家系，除上述3个原发性突变位点外，相继发现 了tRNAMetA4435G、瓜WG11696A、tRNAT虹A15951G、#WT3866C、#WTSSgAC'yWfTlSSSSC和 MWT14502C突变与LHON相关，与线粒体相关的原发性Leber氏病在早期临床症状不明显， 早期的检查常常会因此被耽误，尤其在我国偏远农村地区，该种情况普遍存在。因此，在高 危人群和易感人群中开展mtDNA突变筛查，对于预防和控制与线粒体相关的原发性Leber 氏病的发生有着极其重要的作用。
[0003] 自发现与mtDNA突变相关的疾病W来，检测线粒体突变位点的检测方法主要还是 序列测定。直接测序法是鉴定突变的黄金标准，但该操作繁琐，费用昂贵限制了它的广泛应 用。
[0004] 近年来，国内相继报道了Leber遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒及其检测 方法，W满足对线粒体突变突变进行广泛筛查的需要，如福建医科大学于2005年申请了 的基因诊断试剂盒及其检测方法专利(专利号；200510006097.8)，该发明是根据90%W 上的Leber氏遗传性视神经病变患者的线粒体DM突变属于3个原发性致病位点突变 (G11778A、G3460A和T14484C)，设计和合成位点特异性PCR引物，直接W全血样作PCR的 DNA模板，利用等位基因特异性多重PCR技术，单管一次性PCR反应，同时检测LH0N患者的 线粒体DNA的3个原发性致病突变位点，具有简便快速、高效、费用低、特异性好、只需微量 血液样本等优点，为LH0N患者的快速临床基因诊断提供一种简易、可靠的方法和试剂盒， 具有巨大的普及推广应用价值。但是该方法存在血液中直接PCR扩增的难度加大，实验中 采取的多重PCR的条件要求将会增加，检测方法跟普通的方法没有本质的区别。2006年 杭州优思达生物科技有限公司建立一种W单核巧酸多态性核酸试纸快速检测LHON线粒体 DNA中G11778A位点突变的新方法(专利号；200610003429. 1)。在应用单核巧酸多态性核 酸检测试纸条进行多态位点或突变位点的检测时，需要设计一条特异性延伸引物，该条引 物的3'端碱基紧临多态性碱基或突变碱基，其在DNA聚合酶的作用下开始延伸，带有抗 原标记与模板对应的双脱氧单核巧酸（ddNT巧被连接到延伸引物上。虽然该方法能够实现 短时间内的检测阳性位点，但PCR扩增条件严格，存在假阴性的几率大大增加。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对目前检测MVT3394C突变的方法所存在的缺点，提供一种快 速、简便、准确、经济的检测Leber病相关的线粒体DNAT3394C突变的试剂盒。
[0006] 本发明提供的试剂盒，由DNA提取混合液、扩增T3394C片段的PCR混合液、针对 T3394C设计的一对外引物、针对T3394C设计的一对内引物、限制性内切酶、阳性对照、阴 性对照组成。其中，提取DNA提取混合液主要由细胞裂解液、蛋白酶K、氯仿、苯酪、无水酒 精组成；扩增T3394C片段的PCR混合液试剂包括dNTP(脱氧单核巧酸）、10XPCR缓冲液、 MgC12、S蒸水和Taq酶值NA聚合酶），针对T3394C设计的外引物包括外前向引物F:TAC TTCACAAAGCGCCTTCC(SEQIDN0:1)，外反向引物R:ATGAAGAATAGGGCGAAGGG (SEQIDN0:2);针对T3394C设计的内引物包括内前向引物F:GCAGAGCCCGGTAATCGCATA (SEQIDN0:3)，内反向引物R:GCGAAGGGTTGTAGTAGCCCGTAGGGGCCTACAACGTTGGGGCCTTT GCGTAGTTGTAGCT(SEQIDN0:4);限制性内切酶包括限制性内切酶魁eI;阳性标本对照 是含有线粒体序列第3394位点能够发生酶切样本；阴性标本对照是线粒体序列第3394位 点不发生酶切样本。
[0007] 在上述试剂盒中，在扩增T3394C的PCR混合液中添加用于提高延伸反应特异性的 少许二甲基亚讽（0.1-0.2y1为宜） 本发明的另一个目的是提供所述试剂盒在检测与Leber病相关的线粒体基因 您/T3394C突变中的应用。通过W下步骤实现： (1) 基因组DNA的提取：运用蛋白酶K消化裂解法，从少量的血液标本、带毛囊的毛发、 口腔粘膜刮片或唾液的样本中提取基因组DNA; (2) 特异性PCR扩增；使用Primer5. 0软件和01igo7. 0软件根据SEQIDNO: 5所示 的人类线粒体基因序列所设计的引物F% /R%、Fh/Rh是能扩增出包含上述Leber病的线粒 体突变位点的片段，F外/R外扩增出为线粒体DNA的核巧酸3150-3980,其序列为序列表中 的SEQIDN0:1、2;F内/R内扩增出为线粒体DNA的核巧酸3239-3455,其序列为序列表中 的沈QIDN0:3、4 (3) 酶切鉴定；将上述PCR产物用限制性内切酶魁eI对T3394C突变位点处进行酶 切； (4) 突变检测；聚丙締酷胺凝胶电泳检测，直接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量 及DNA片段大小，检测mtDNA是否发生T3394C突变。
[0008] 在上述检测mtDNAT3394C突变的方法中，可从血标本巧日一滴血)、带毛囊的毛发、 口腔粘膜刮片或唾液的样本中快速提取基因组DNA，根据取样方式或被测样本形式不同，对 不同样本进行相应的预处理，处理方法如下： (1) 血标本巧日一滴血）；取20~200y1少量血标本巧日一滴血）或1cm2的血滤纸片放 入1.5mlEP管(离屯、管)，加入900yl红细胞裂解缓冲液（20mmol/LTris-HCl，抑7.6)(S 哲甲基氨基甲烧-盐酸缓冲液）室温静置lOmin，充分裂解红细胞，12000巧m离屯、Imin，收 集白细胞沉淀； (2)带毛囊的毛发：用70%己醇洗带毛囊的毛发1次，后再用蒸馈水冲洗毛发2次。在 1.5ml EP管中分别放入2~4根毛发，毛囊置于EP管底部，用干净的剪刀剪去毛发高于EP 管的部分； (3) 口腔粘膜刮片或唾液：收集唾液前，必须让被收集者漱口。W除去口腔中过多的老 化细胞、食物残渣、牙膏、咖啡、烟等物质。半小时内不要喝水、进食、吸烟，然后开始收集口 腔粘膜刮片或唾液，可视条件选择如下方法收集唾液样本；①舌头围绕口腔刮取粘膜细胞， 将约0. 1ml唾液直接吐进EP管内；②生理盐水漱口，吐进EP管内，吸取PBS溶液至装有通 过上述任一种方法收集的唾液样本的EP管中，反复吹打后，12000rpm离屯、5min，除去上清， 重复该过程一次；⑨用棉拭子反复刮拭面颊内壁6次，空气中干燥，然后用灭菌过的綴子小 屯、撕去其外表面，放入EP管中；④将唾液吐在滤纸上，空气中干燥后形成唾液斑，再用干净 的剪刀剪成大小约1cm2碎纸片置于EP管中。
[0009] 然后用细胞裂解液和蛋白酶K对上述样本进行消化裂解，利用盐析法去除蛋白等 杂质，异丙醇沉淀DNA，最后用高压灭菌水溶解后于-20°C保存备用。
[0010] 在本发明的实施方案中，引物设计的指导思想是，针对mtDNA T3394C位点存在的 位置相邻近，扩增在一条片段上，故应设计3'末端与3394位点野生型T和3394位点突变 型C相对应的上游引物；针对3394位点设计3'末端分别与3394位点野生型T和3394位 点突变型C相对应的下游引物。（参照图1) 本发明人针对特异性PCR扩增后（图2)，mtDNAT3394C位点形成了酶切位点。酶切位 点是由mtDNAT3394C突变形成的，其中的限制性内切酶为MeI，其位点处为序列表中的 沈QIDN0:3、4 ; 用W上设计的引物，W相应的被检测样本的DM为模板，通过PCR扩增后分别获得明亮 清晰的大小约2nbp的恒定扩增带，3394突变位点对应于扩增片段的第155位。
[0011] 在上述检测线粒体基因Leber病突变的方法中，结合特异性PCR技术和酶切技术， 每份DNA样本分别用特异性引物即引物F/R于PCR反应管中进行普通PCR扩增，然后进行突 变位点处的酶切，通过一次PCR便可在几小时内检出Leber病相关的mtDNA T3394C突变。
[0012] 理论上，基因组DNA样本经一次PCR反应，即体系中仅加入针对突变型位点T3394C 引物F/R后，加入针对突变位点新形成的限制性内切酶MeI进行酶切，就可进行检测。也 就是说，同一基因组DNA样本经一次PCR-酶切，从而使检测结果更为准确、可信。
[0013] 本发明人还根据本发明中设计的引物序列，通过人工合成(委托生物公司）获得引 物，并将引物按一定的比例混合，与提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标 本对照、阴性标本对照W及使用说明书组合起来，制成了用于体外检测母系遗传Leber病 线粒体基因mtDNAT3394C突变的试剂盒，使得样本DNA提取、特异性PCR扩增和酶切可W 在试剂盒提供的试剂基础上顺利完成。其中，提取样本DNA的试剂主要由细胞裂解液和溶 液I(主要成分是蛋白酶K)组成；PCR扩增反应试剂包括dNTP、10XPCR缓冲液、MgCl2、S 蒸水和Taq酶，限制性内切酶包括限制性内切酶MeI。
[0014] 用本发明的方法及其制备的体外检测Leber病相关的线粒体基因mtDNAT3394C 突变试剂盒具有W下特点： 1.传统上获得Leber病患者基因组DNA的方法是从血液中提取，每人大约需要3~ 5ml。该种采血方法给很多被检者尤其是婴幼儿带来了一些痛苦和伤害，而且在跨地区传递 样本时存在一定的风险和麻烦。本发明运用蛋白酶K消化裂解法，从少量的血液标本巧曰一 滴血)、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液等样本中快速提取基因组DNA。该方法不