miR-455-3p在食管鳞状细胞癌中的诊断、治疗和预后的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种新的microRNA及其Antagomir的应用，特别涉及 miR-455_3p 及 Antagomir-455_3p 的应用。
【背景技术】
[0002]食管鳞状细胞癌(Esophagealsquamous cell carcinoma，ESCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率占第六位。我国大约90%的食管癌为鳞状细胞癌，并且其具有显著的地域性，高发区的食管鳞状细胞癌发病率是低发区的500倍。烟酒史、营养缺失、热食以及摄入致癌物等因素都与食管鳞状细胞癌相关。外科手术、放化疗是食管鳞状细胞癌的重要治疗手段，但是其5年生存率只有10%左右。耐药性是食管鳞状细胞癌治疗难以攻克的难关。传统的药物难以杀灭肿瘤干细胞。肿瘤干细胞既具有类似于正常干细胞的特性，如自我更新，低分化及药物抵抗；又具有肿瘤细胞的恶性发展能力。深入了解食管鳞状细胞癌的耐药机制可以制定食管鳞状细胞癌风险评估和有效的诊断措施，并且可以为肿瘤治疗提供新的靶点。
[0003]microRNA，通常长度为19?25个核苷酸，广泛存在于各种动植物甚至单细胞真核生物中，是一类在进化上高度保守的小分子单链RNA。最近的研宄发现，microRNA表达与多种癌症相关，大约50%得到注解的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点(fragile site)。这说明miRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用，其主要通过结合到多种靶向mRNAs的3’ UTR从而抑制mRNAs的转录。
[0004]Antagomir是根据microRNA成熟体序列而设计，经过特殊标记与修饰的单链RNA，专门用于抑制内源性microRNA的高效阻断剂。Antagomir长度一般在22_25nt，3’端进行胆固醇(cholesterol)标记和四个硫代磷酸(PS)位点修饰，5’端两个硫代磷酸(PS)位点修饰，全链2-甲基化修饰，提高杂交效率和优越的稳定性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种食管鳞状细胞癌的检测试剂盒。
[0006]本发明的另一目的在于提供一种食管鳞状细胞癌的预后诊断试剂盒。
[0007]本发明的再一目的在于提供一种治疗食管鳞状细胞癌的药剂。
[0008]本发明所采取的技术方案是: miR-455-3p作为肿瘤检测、治疗、预后靶点的应用。
[0009]一种肿瘤检测试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测miR-455_3p的试剂。
[0010]进一步的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455_3p的引物序列。
[0011]进一步的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455_3p的引物序列:5，-GCAGTCCATGGGCATATACAC-3，(SEQ ID NO:1)和 5，-ACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3’ (SEQ IDNO:2)o
[0012]一种肿瘤的预后试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测miR-455_3p的试剂。
[0013]进一步的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455_3p的引物序列。
[0014]进一步的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455_3p的引物序列:5，-GCAGTCCATGGGCATATACAC-3，(SEQ ID NO:1)和 5，-ACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3’ (SEQ IDNO:2)o
[0015]一种治疗食管鳞状细胞癌的药剂，该药剂中含有抑制miR-455_3p表达的试剂。
[0016]进一步的，上述抑制miR-455_3p表达的试剂选自miR-455_3p的措抗剂Antagomir、miR-455_3p的反义链中的至少一种。
[0017]本发明的有益效果是:
本发明在食管鳞状细胞癌的肿瘤细胞中发现了 miR-455-3p，在207例病人组织样本及15例健康组织样本中发现，miR-455-3p在食管鳞状细胞癌病人中高表达，这提示miR-455-3p具有成为肿瘤辅助诊断标记物的潜能。进一步，发明人发现miR-455_3p高表达与食管鳞状细胞癌患者5年总生存率及无病生存率显著负相关，miR-455-3p高表达明确指示较差的生存预后。这提示了 miR-455-3p具有成为食管鳞状细胞癌患者生存预后指标的潜能。体内和体外的功能性研宄分析表明，miR-455-3p能够促进食管鳞状细胞癌细胞的恶性发展，Antagomir-455-3p功效与其相反。此外，抑制miR-455_3p的表达能够抑制肿瘤干细胞特性和增强其对化疗药物的敏感性。并且，抑制miR-455-3p的表达可抑制肿瘤干细胞相关生物标志物的表达。综上所述，本研宄发现Antagomir-455-3p是肿瘤干细胞的重要抑制物，在癌症的发展过程中具有重要意义。此外，Antagomir-455-3p能够降低癌症干细胞对化疗药物的敏感性。检测癌症病人中miR-455-3p的表达，可以作为食管鳞状细胞癌的辅助诊断和/或预后判断。本发明为肿瘤疾病提供了新的诊断、治疗方法和药物筛选平台。
【附图说明】
[0018]图1为miR-455-3p在ESCC临床标本和细胞系中表达情况及生存预后情况；显示为miR-455-3p在ESCC的TCGA数据库、临床标本和细胞系中表达上调，miR-455_3p高表达与患者 5 年总生存率(Overall survival, OS)及无病生存率(Disease-free survival,DFS)呈显著负相关；
图2为原代ESCC肿瘤细胞经CDDP药物筛选后分为CDDP处理的ESCC (EC-CR)和CDDP未处理的ESCC (EC-NT), EC-CR的耐药性、肿瘤发生率、肿瘤干性等功能均高于EC-NT ；
图3为mi croRNA表达谱分析EC-CR和EC-NT细胞中mi croRNA的表达情况，显示miR-455-3p在EC-CR和EC-NT细胞中均表达上调；
图4为miR-455-3p的体内体外的功能实验。体外实验中的克隆形成实验、SP+分选实验、CD90+实验显示高表达miR-455-3p促进ESCC的肿瘤细胞干性；而抑制miR-455_3p的表达抑制了 ESCC肿瘤细胞干性。体内实验中高表达miR-455-3p增强了 ESCC细胞的体内成瘤能力，而沉默miR-455-3p的表达减弱了 ESCC细胞的体内成瘤能力；
图5为miR-455-3p的表达量对ESCC肿瘤的的影响，高表达miR-455_3p增强了 ESCC细胞的淋巴结和肺内转移，而沉默miR-455-3p的表达减弱了 ESCC细胞淋巴结和肺内转移；图6为miR-455-3p表达量与肿瘤对化疗药物的敏感性的关系，显示为高表达miR-455-3p增强对化疗药物⑶DP和5-FU的耐药性；在肿瘤形成过程中高表达miR-455_3p促进了肿瘤细胞的生长；在肿瘤形成过程中，注射Antagomir-455-3p可抑制肿瘤细胞对化疗的药物的影响，抑制肿瘤的生长；
图7为TargetScan网站预测结果显示miR-455_3p可能通过作用于PTPN9、PIAS3、S0CS3、DKK3、GSK3 β、SMURFl、NEDD4L、PPM1A 这 8 个基因 mRNA 的 3’ UTR 发挥功能；miRNPs 免疫共沉淀实验、免疫印迹实验检测表明高表达miR-455-3p促进RISC复合体(RNA-1nducedsilencing complex)与靶基因 PTPN9、PIAS3、S0CS3、DKK3、GSK3 β、SMURFU NEDD4L、PPMlA的mRNA结合，下调靶基因的蛋白表达水平，进一步，双荧光素酶活性检测结果表明miR-455-3p通过作用于靶基因的mRNA的3’ UTR元件抑制荧光素酶的表达。
【具体实施方式】
[0019]miR-455-3p作为肿瘤检测、治疗、预后靶点的应用。
[0020]一种肿瘤检测试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测miR-455_3p的试剂。
[0021]优选的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455_3p的引物序列。
[0022]优选的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455_3p的引物序列:5，-GCAGTCCATGGGCATATACAC-3，(SEQ ID NO:1)和 5，-ACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3’ (SEQ IDNO:2)o
[0023]一种肿瘤的预后试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测miR-455_3p的试剂。
[0024]优选的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455_3p的引物序列。
[0025]优选的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455_3p的引物序列:3，-GCAGTCCATGGGCATATACAC-5，(SEQ ID NO:1)和 3，-ACTGGTGTCGTGGAGTCGG-5’ (SEQ IDNO:2)o
[0026]一种治疗食管鳞状细胞癌的药剂，该药剂中含有抑制miR-455_3p表达的试剂。
[0027]优选的，上述抑制miR-455_3p表达的试剂选自miR-455_3p的措抗剂Antagomir、miR-455-3p的反义链中的至少一种。
[0028]优选的，上述miR-455_3p 的措抗剂 Antagomir 为 Antagomir-455_3p，其序列为GTGTATATGCCCATGGACTGC (SEQ ID NO:3)并携带有一个锁环结构。
[0029]优选的，上述miR-455-3p 的反义链的序列为 GTGTATATGCCCATGGACTGC(SEQ ID NO:4)0
[0030]优选的，上述肿瘤为食管鳞状细胞癌。
[0031]下面结合具体实施例子，进一步阐明本
【发明内容】
。下列实施例中未标明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(第三版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0032]实施例1 miR-455_3p在ESCC样本中表达上调 (I) TCGA数据库分析
方法:运用SPSS统计学分析法，分析The Cancer Genome Altas Project (TCGA)中186例ESCC病人和13例ESCC癌旁组织的miR-455_3p的表达水平及其与生存率的关系。所有统计学分析用SPSS17.0统计软件进行处理。数值用均数土SD表示，K0.05认为在统计学上有显著性差异。
[0033]分析结果显示ESCC肿瘤组织中miR-455_3p表达量明显高于癌旁组织样本(K0.001)，差异具有统计学意义(如图1-A所示)；定义miR-455-3p在ESCC肿瘤组织中的表达超过中位数的表达，称为miR-455-3p高表达；ESCC肿瘤组织miR-455_3p表达低于中位数的表达，称为miR-455-3p低表达，从图1-B中可以看出miR-455_3p的高表达预示了病人较差的预后。
[0034](2) RT-qPCR检测miR-455_3p在ESCC的临床标本中的表达
方法:采用RT-qPCR方法检测miR-455的表达水平:逆转录引物:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGTGTATAT (SEQ ID NO:9), miR-455 PCR 检测引物序列:5’ -GCAGTCCATGGGCATATACAC-3’ (SEQ ID NO:1),通用引物序列:5 ’ -ACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3 ’ (SEQ ID NO: 2 )。(I)依靠逆转录酶将 RNA 转变成 cDNA ；(2)PCR扩增cDNA ；(3)实时监测和定量测定cDNA的量。检测207例ESCC肿瘤标本和15例健康成人食管组织中miR-455-3p的表达。运用SPSS统计软件分析miR-4