使用CYP153烷烃羟化酶由烷烃或1-烷醇生产α,ω-二醇的方法
【专利说明】使用CYP153烷烃羟化酶由烷烃或1 -烷醇生产α , ω - 二醇的方法
[0001]本发明涉及包括如下步骤的方法
a)提供烧径或1-烧醇，
b)使所述烷烃或1-烷醇在水溶液中与来自CYP153家族的细胞色素P450烷烃羟化酶和氧气接触至少3小时。
[0002]取代的烷烃，例如醇、醛、酮、羧酸和胺，代表了一类在工业上受欢迎的化合物，这些化合物传统是通过对由化石碳源制得的化合物进行转化来制备。在不可再生的矿物燃料的供应日益受限的时代，从可再生资源(即可以容易地和(从地质年代表的角度来看)快速地补充的材料)开始生产烷烃及其衍生物的生物技术工艺受到广泛关注。
[0003]现有技术中已报道了多种将烷烃转化为取代的烷烃，特别是氧化烷烃的方法。甲烷单加氧酶催化一个氧原子NADH-依赖性地插入甲烷的特别稳定的C-H键，形成甲醇，这是通过甲烧氧化菌如发孢甲基弯菌{Methylosinus trichosporium)和荚膜甲基球菌{Methylococcus capsulatus)降解甲烧的第一步。可溶性甲烧单加氧酶典型地具有宽的底物范围，包括至多达大约C8的饱和的和不饱和的、线性的、分枝的和环状的烃，以及芳香的、杂环的、和含氯的化合物(Merkx M, Kopp DA, Sazinsky MH, Blazyk JL, MilllerJ, Lippard SJ (2001), Angew Chem Int Ed Engl 40:2782-2807; Higgins IJ, BestDJ, Hammond RC.1980)。在甲烷利用细菌中的新发现突出了它们在生物圈的重要性和它们的商业潜力。依赖于红素氧还蛋白的烧径单加氧酶如来自恶臭假单胞菌iPseudomoimsput I da) GPol的烷烃单加氧酶催化中等链长度的烷烃的氧化，产生醇和羧酸的混合物
(Grant C., Woodley, J.M, and Baganz, F (2011) Enzyme and Microbial Technology48, 480-486)。
[0004]但是，具有两个或更多个取代的烷基对于许多应用来说是必不可少的，例如在工业聚合物的生产中作为交联剂，在这种情况下，通过这种生物技术方法可以获得的取代度受到限制。已报道有许多系统将烷烃转化为相应的1-烷醇，但是存在很少的可以用于生产相应的α，ω-二醇的生物技术方法，α，ω - 二醇即其中两个末端碳原子的每一个都携带一个羟基的烷基链。而且，许多氧化酶易于过度氧化烷烃底物，导致不希望的醛和羧酸污染所需的醇产物的效果。最后，氧化需要是有选择性的，这意味着优选除了末端碳原子之外的烷烃碳原子不应被氧化。
[0005]因此，本发明的根本问题提供了将烷烃或1-烷醇转化为相应的α，ω- 二醇的生物技术路线，其中过度氧化的程度受到限制，和/或反应是足够特异性的，优选除末端碳原子之外的碳原子不被取代或者被取代的程度较低。
[0006]在第一方面，本发明的根本问题通过包括下述步骤的方法来解决
a)提供烧径或1-烧醇，
b)使所述烷烃或1-烷醇在水溶液中与来自CYP153家族的细胞色素P450烷烃羟化酶和氧气接触至少3小时。
[0007]在第二方面，本发明的根本问题通过使用来自CYP153家族的细胞色素P450烷烃羟化酶使烷烃或1-烷醇转化为相应的α，ω - 二醇来解决。
[0008]在第一或第二方面的第一实施方案中，通过方法或用途解决问题，其中在存在来自CYP153家族的细胞色素Ρ450烷烃羟化酶的条件下温育烷烃或1_烷醇至少3、优选16、最优选24小时。
[0009]在第一或第二方面的第二实施方案中，其也是第一或第二方面的第一实施方案的实施方案，通过方法或用途解决问题，其中，除了来自CYP153家族的细胞色素Ρ450烷烃羟化酶之外，还存在铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶，其中铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶两者均能够在功能上与所述来自CYP153家族的细胞色素Ρ450烷烃羟化酶相互作用。
[0010]在第一或第二方面的第三实施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第二实施方案的实施方案，通过方法或用途解决问题，其中来自CYP153家族的细胞色素Ρ450烷烃羟化酶是来自泊库岛食烧菌iAlcrniivorax borkumensis)的CYP153家族的细胞色素P450烧烃羟化酶(登录编码YP_691921)或其变体，铁氧还蛋白是来自泊库岛食烷菌的铁氧还蛋白(登录编码ΥΡ_691921)或其变体，并且铁氧还蛋白还原酶是来自泊库岛食烷菌的铁氧还蛋白还原酶(登录编码ΥΡ_691923)或其变体。
[0011]在第一或第二方面的第四实施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第三实施方案的实施方案，通过方法或用途解决问题，其中烷烃或1-烷醇是具有1-7个，优选1-4个碳原子的烷烃。
[0012]在第一或第二方面的第五实施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第四实施方案的实施方案，通过方法或用途解决问题，其中烷烃是丁烷或异丁烷。
[0013]在第一或第二方面的第六实施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第五实施方案的实施方案，通过方法或用途解决问题，其中烷烃或1-烷醇是具有1-7个碳原子的1-烷醇，优选丁醇或异丁醇。
[0014]在第一或第二方面的第七实施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第六实施方案的实施方案，通过方法或用途解决问题，其中烷烃是以分压1-50，优选1-20，最优选1-10 bar提供的气态烷烃。
[0015]在第一或第二方面的第八实施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第七实施方案的实施方案，通过方法或用途解决问题，其中至少一种选自包含来自CYP153家族的细胞色素P450烷烃羟化酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的组的酶以表达所述一种酶(enzyme)或多种酶(enzymes)的全细胞催化剂的形式提供。
[0016]在第一或第二方面的第九实施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第八实施方案的实施方案，通过方法或用途解决问题，其中所有选自包含来自CYP153家族的细胞色素P450烷烃羟化酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的组的酶以表达所述酶的全细胞生物催化剂的形式提供。
[0017]在第一或第二方面的第十实施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第九实施方案的实施方案，通过方法或用途解决问题，其中至少一种，优选所有选自包含来自CYP153家族的细胞色素P450烷烃羟化酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的组的酶是重组的和/或过表达的，优选是过表达的。
[0018]在第一或第二方面的第十一实施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第十实施方案的实施方案，通过方法或用途解决问题，其中全细胞生物催化剂表达来自AlkL家族的多肽，优选来自恶臭假单胞菌的AlkL (登录编码CAB69081)或其变体。
[0019]在一个或第二个方面的第十二实施方案中，其也是第一或第二方面的第一至第十一实施方案的实施方案，通过方法或用途解决问题，其中全细胞生物催化剂是原核细胞，优选大肠杆菌{E.coli)。
[0020]在第三方面，本发明的根本问题通过使用根据第一或第二方面的方法或者第一或第二方面的任一实施方案使烷烃转化为相应的α，ω-二醇来解决。
[0021]本发明基于令人惊讶的发现，即来自CYP153家族的细胞色素Ρ450烷烃羟化酶可用于将烷烃不仅转化为相应的1-烷醇，而且还转化为相应的α，ω-二醇。
[0022]本发明集中于方法或用途，其包括使烷烃或1-烷醇与来自CYP153家族的细胞色素Ρ450烷烃羟化酶接触的步骤。在优选的实施方案中，本文使用的术语“来自CYP153家族的细胞色素Ρ450烷烃羟化酶”指胞质细胞色素氧化酶，其是3组分系统的天然部分，所述3组分系统不仅包括氧化酶，还包括铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶，其中氧化酶具有烷烃结合位点并能使烷烃羟基化。在更优选的实施方案中，来自CYP153家族的细胞色素Ρ450烷烃羟化酶与来自泊库岛食烷菌SK2的细胞色素Ρ450氧化酶(登录编码ΥΡ_691921)具有至少80%，优选90%，更优选95%以及最优选99%的氨基酸序列同一性，此外还具有烷烃羟化酶活性。在另一个优选的实施方案中，细胞色素Ρ450烷烃羟化酶除了具有所述氨基酸序列同一性程度、所述结合位点和所述烷烃羟化酶活性之外，还具有氨基酸序列基序LL(I/L) (V/I)GGNDTTRN。本申请通篇引用的数据库编码指NCBI数据库2012年10月12日在线版本的编码。
[0023]为了尽可能有效地从还原剂提供电子供应，以维持细胞色素P450烷烃羟化酶的羟化酶活性，优选烷烃羟化酶与功能上与所述烷烃羟化酶相互作用的铁氧还蛋白还原酶以及铁氧还蛋白组合使用。在使用全细胞生物催化剂提供细胞色素P450烷烃羟化酶的情况下，铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶可以是分离的多肽，或者可以是共表达的。本领域技术人员可以容易地通过在存在烷烃底物和三种多肽的条件下，监测还原剂的氧化是否超出背景水平，来确定铁氧还蛋白还原酶和/或铁氧还蛋白是否与目标细胞色素P450烷烃羟化酶在功能上相互作用，所述三种多肽优选是分离的多肽。或者，在使用在功能上相互作用的多肽的情况下，可以使用 Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B.M, undHauer, B.(2011) Org.B1mo1.Chem., 9, 6727所述的酶测定来指示升高的反应速率。在优选的实施方案中，来自CYP 153家族的细胞色素Ρ450烷烃羟化酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶来自相同生物体，优选来自泊库岛食烷菌SK2，在这种情况下，登录编码分别是 ΥΡ_691921、ΥΡ_691923 和 ΥΡ_691920。
[0024]在优选实施方案中，本文使用的术语“接触”是使烷烃或1-烷醇与氧化还原酶之间发生直接接触，以使得后者能够氧化前者。例如，细胞和烷烃或1-烷醇可能不处于由膜(例如对于目标细胞和烷烃或1-烷醇来说是不能渗透的无机膜)分隔开的不同的空间中。如果烷烃或1-烷醇是固体的或是可溶的，可以简单地将其加入到水溶液中的氧化还原酶中。如果烷烃或1-烷醇是气态的，包含细胞的水溶液可以与包含所述气态烷烃或1-烷醇的