一种脱乙酰基酶突变体及其应用
【专利说明】
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技术领域
[0002] 本发明涉及基因工程及微生物发酵领域，具体来说，涉及一种大肠杆菌UDP-3-0-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体基因及其表达及其制备方法。
[0003]
【背景技术】
[0004] 葡萄糖胺（D_glucosamine，GlcN)盐酸盐是最新的第三代保健功能性食品添加剂， 主要用于各种关节炎症，能起到有效的治疗作用。现在世界各地有大量患者忍受不同程度 关节炎痛苦，仅美国就有3300万人忍受骨关节炎及关节疼痛，我国有1. 5亿人以上。正是 由于葡萄糖胺应用范围广泛，特别是在关节炎及关节疼痛的治疗与保健功能方面，使其已 成为目前国外市场非常走俏的原料药品种，而国内还没有形成规模化市场。
[0005] 传统的D-葡萄糖胺生产方法是使用甲壳类动物如蟹、虾类的壳作原料来实现的。 方法概括为：将甲壳类动物的壳压碎；用稀释的酸溶液对压碎的产品脱钙；用碱去除蛋白 质以生产纯化的甲壳素；用酸水解得到的甲壳素以生产葡萄糖胺。用酸水解甲壳素生产 葡萄糖胺的方法，还包括使用来自真菌渣(柠檬酸发酵使用的黑曲霉菌的菌渣)，如美国专 利US7049433B2公开的在高浓度盐酸下水解生产葡萄糖胺的方法。同时，常规方法还包括 W02004/003175公布的涉及使用遗传修饰的微生物，特别是遗传修饰的大肠杆菌，发酵生产 N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖胺盐酸盐的方法。
[0006] 以上所述的用甲壳类动物(如蟹、虾类)的壳或柠檬酸渣作原料化学水解生产D-葡 萄糖胺的方法，是通过使用高浓度的酸溶液和碱溶液来实现的，因此存在产生大量废液的 问题。用虾蟹壳提取每生产1吨产品将产生大量废渣和100吨以上废水，用柠檬酸渣提取 每30-50吨渣才能产1吨产品。同时，如果对甲壳类过敏的个体食用了用蟹、虾类的壳作原 料获得的产品，可能出现过敏症状。许多有水产品过敏的人使用后会造成严重的问题，甚至 危及生命。而且，甲壳素的材料来自鱼类资源，它的供应依赖于鱼类的捕捞，过度的捕捞将 会引发环境的破坏。另外，由于环境污染，从虾蟹壳中提取不可避免的受到重金属污染。此 外，通过培养遗传修饰的微生物生产N-乙酰-D-葡萄糖胺的方法需要一些措施来防止微生 物在设备内的扩散，因此存在操作复杂的问题和与食品安全有关的危及社会的问题。化学 合成方法制备葡萄糖胺目前国内外很少使用，因为生产成本高、严重的环境污染、存在安全 性隐患。而微生物发酵法生产葡萄糖胺是一条良好的途径，因为发酵法生产葡萄糖胺无鱼 腥味，生产不受季节和资源限制。但是，由于葡萄糖胺易于降解，而且降解产物对细胞有毒 性。所以，微生物发酵法生产葡萄糖胺一般采用以在发酵液稳定的N-乙酰葡萄糖胺为目标 产物的生产方式。
[0007] 将N-乙酰葡萄糖胺变成葡萄糖胺，传统的做法是化学水解法，即将N-乙酰葡萄糖 胺通过高浓度盐酸进行去乙酰化处理。然而，该过程会产生大量稀盐酸和废酸水，污染环 境。同时，生产过程中，也有损耗，因为N-乙酰-D-葡萄糖胺化合物结构中含有比较脆弱的 酯键，在脱去糖基上的乙酰基同时酯键难免被破坏，影响收率。
[0008] 另一种方法是通过酶法将N-乙酰葡萄糖胺去乙酰化生产葡萄糖胺。酶法制备葡 萄糖胺显然是一条减少污染的有效途径，但最重要的问题是如何获得专一性而高效的酶， 进行脱乙酰基反应。
[0009] 过去的研宄显示，甲壳素脱乙酰酶可以催化水解甲壳素的N-乙酰基，甲壳素脱乙 酰酶广泛存在于自然界，尤其是一些真菌和昆虫中。这些酶都是糖蛋白，而且都表现出较高 的热稳定性和严格的专一性（只作用于水溶性的以0-1，4键相连的N-乙酰-D-葡糖胺聚 合物）。但是对于水不溶甲壳素，酶法脱乙酰效果并不理想。为此，需要在加酶前对甲壳素 进行处理，以改善酶与底物之间的相互作用，对于提高酶催化脱乙酰的速度和产率是必要 的。不同来源甲壳素脱乙酰酶的特性比较发现，甲壳素脱乙酰酶催化水解底物的乙酰基符 合多作用位点模式作用位点为3个。酶与底物结合形成复合物，并催化水解多个（1个以 上）乙酰基后，与底物分开，再与其他底物结合，继续发挥催化作用。通过研宄鲁氏毛霉（# .甲壳素脱乙酰酶催化聚合度为2~7的甲壳低聚糖脱乙酰，发现低聚物的聚合 度对于酶的作用模式有很大影响。但该酶不能催化水解聚合度小于3的甲壳素低聚物脱乙 酰，能够催化水解4-N-乙酰壳四糖和5-N-乙酰壳五糖脱去全部乙酰基。
[0010] 此外，人们尝试过许多N-乙酰葡糖胺酶，如N-脱乙酰酶（N-deacetylase)、N-脱 乙酰基酶/N-磺基转移酶（N-Deacetylase/N-Sulfotransferases)、N-乙酰葡糖胺脱乙酰 酶（N-Acetylglucosamine deacetylase)、N_ 乙酰葡糖胺 _6_ 磷酸脱乙酰酶（N-Acetylglu cosamine-6-phosphate deacetylase)，均未获得很好效果。
[0011] 大肠杆菌UDP-3H-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶（UDP-3-O-acyl N-acetylglucosamine deacetylase，LpxC)是催化革兰氏阴性菌外膜脂多糖主要成分类脂 A的关键酶，负责类脂A合成第二步中UDP-3-0(R-3-羟基肉豆蔻酰基）-N -乙酰葡萄糖胺 脱乙酰基工作，而LpxC在革兰阴性菌中高度保守，并在结构和序列上与各种哺乳动物蛋白 都不同源。
[0012] 针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
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【发明内容】
[0014] 本发明的目的是提供一种大肠杆菌UDP-3-0TV_乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体 基因及其表达及其制备方法，以克服目前现有技术存在的上述不足。
[0015] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现： 根据本发明的一方面，提供了一种大肠杆菌UDP-3-0-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突 变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，或将所述SEQ ID NO. 1所示序列经替换、缺失或 添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0016] 根据本发明的另一方面，提供了一种编码所述大肠杆菌UDP-3-0-N -乙酰葡萄 糖胺脱乙酰基酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示，或Seq ID N0. 2所示 的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸 序列；或在严格条件下与Seq ID N0. 2所示序列杂交的核苷酸序列，所述严格条件为在含 0. 1%SDS的0. 1XSSPE或含0. 1%SDS的0. 1XSSC溶液中，在65°C下杂交，并用该溶液洗膜。
[0017] 根据本发明的另一方面，提供了一种含有上述基因的重组载体。
[0018] 根据本发明的另一方面，提供了一种转基因细胞系，该转基因细胞系含有编码基 因的重组载体。
[0019] 根据本发明的另一方面，提供了一种重组菌，该重组菌含有编码基因的重组载体。
[0020] 进一步的，其出发菌株为大肠杆菌。
[0021] 根据本发明的另一方面，提供了一种碱基优化后的UDP-3-0-N-乙酰葡萄糖胺脱 乙酰基酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 7所示。
[0022] 根据本发明的另一方面，提供了一种大肠杆菌UDP-3-0-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰 基酶突变体的制备方法，包括以下步骤： 步骤1:通过PCR技术扩增编码预先准备好的大肠杆菌UDP-3-0-N-乙酰葡萄糖胺脱 乙酰基酶突变体的基因； 步骤2:将步骤1所得PCR产物连接表达载体pET-24a; 步骤3:连接产物转入预先准备好的大肠杆菌感受态细胞，获得表达产物； 其中，步骤1中PCR扩增所用引物为： 正向引物：5'- GGGAATTCCATATGATCAAACAAAGGACACT-3'； 反向引物：5'- CGGAAITCATTATGCCAGTACAGCTGAAGG-3'。
[0023] 本发明的有益效果为：通过易错PCR的方法对野生型大肠杆菌UDP-3-0-N-乙酰 葡萄糖胺脱乙酰基酶（LpxC)进行突变，获得最高酶活达163.2IU/ml的突变体菌株，是野生 型菌株酶活力的9. 3倍；并且本发明涉及的生产产品葡萄糖胺和乙酰葡萄糖胺的应用范围 广泛，有利于市场的推广与应用。
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【具体实施方式】
[0025] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026] 本发明提供一种酶法将N-乙酰葡萄糖胺去乙酰化生产葡萄糖胺的方法。以大肠 杆菌UDP-3-0-N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶（LpxC)为对象，通过错误倾向（聚合酶链式反 应）易错PCR随机诱变法，引进随机的碱基替换，进行DNA改组，筛选该酶的理想突变体，作 为N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基有效工具。
[0027] 为此，采用易错PCR向UDP-3-0-N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶基因中引入突变，再 结合DNA改组对其进行改造，转化大肠杆菌，构建改组文库，进行试管初筛，摇瓶复筛，最终 得到高活性酶突变体。
[0028] 与野生型的UDP-3-0-N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶基因测序比对，该突变体基因 较原基因发生了 8处碱基点突变，致氨基酸5处错义突变。本发明的UDP-3-0-N-乙酰葡 萄糖胺脱乙酰基酶突变体发生改变的氨基酸序列为：K23E (第23位赖氨酸变为谷氨酸）， V112L (第112位缬氨酸变为亮氨酸），F161I (第161位苯丙氨酸变为异亮氨酸），R222G (第222位精氨酸变为甘氨酸），A29 IP (第291丙氨酸变为脯氨酸）。
[0029] 野生型的UDP-3-0-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所 示，核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0030] 本发明还提供所述大肠杆菌UDP-3-0-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体在乙酰 葡萄糖胺去乙酰化中的应用。
[0031] 所述大肠杆菌UDP-3-0-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶突变体的筛选方法，包括以 下步骤： 步骤1 :从大肠杆菌（fccAericAia co/i)基因组DNA中，PCR扩增LpxC的编码基因 LpxC ； 其中，PCR扩增所用引物为： 正向引物（T7LpxC_F)SeqID N0.5: 5' -GGGAATTCCATATGATCAAACAAAGGACACT-3,{Ndel)； 反向引物（T7LpxC_R)SeqID N0.6: 5' -CGGAATTCATTATGCCAGTACAGCTGAAGG-3,{EcoRl)〇
[0032] 本发明的大肠杆菌UDP-3-0-N -乙酰葡萄糖胺脱乙酰基酶编码基因还可以通过人 工合成序列的方法获得。
[0033] 步骤2:采用易错PCR技术，以LpxC的编码基因LpxC为模板，扩增获得LpxC突变 体基因； 步骤3 :将步骤2所得易错PCR产物用feo/tV双酶切后，与feo/PT酶切 的口￡1'-24(1(+)载体连接，连接产物转入大肠杆菌此21(0￡3)感受态细胞，涂布至1^〇(&11) 平板，将平板置37°C恒温培养箱培养，即得构建好的重组LpxC基因突变库； 步骤4 :LB (Kan)