大肠杆菌基因组整合载体、基因工程菌以及在生产木糖醇中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程和生物技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌基因组整合载体、 基因工程菌以及在生产木糖醇中的应用。
【背景技术】
[0002] 木质纤维素生物质是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，随着化石燃料等不可 再生资源的日益枯竭，可再生资源的开发利用逐渐受到人们的重视，利用生物质资源生产 生物基化学品和燃料是当前研宄的热点。木质纤维素包括纤维素、半纤维素和木质素，其 中利用纤维素生产燃料乙醇研宄已经很成熟并有工业化生产实例；木质素由于成分较为复 杂，研宄较为缓慢，并没有取得重大进展；约占木质纤维素原料5%~30%的半纤维研宄正 引起人们的广泛关注。半纤维素的主要成分是木聚糖，其经过简单的酸解就能获得木糖，利 用木糖生产木糖醇从碳元素利用而言，是原料利用率最高的途径之一。木糖醇是来源于木 糖的附加值最高、市场需求最大的化学品。木糖醇是一种五碳糖醇，其甜度与蔗糖相当，热 量值却只有其60%左右，木糖醇具有抗龋齿及代谢不依赖胰岛素、改善肝功能等特点，广泛 应用于食品、医药和化工行业；2004年美国能源部从300多种候选化学品中筛选出12个最 具应用前景的来源于生物质的基础化学品，木糖醇就是其中之一。
[0003] 工业上生产木糖醇主要是利用半纤维素酸水解获得木糖，经分离纯化后得到纯度 在95%以上的木糖在高温高压条件下用镍催化加氢制得，这种工艺条件苛刻，且容易造成 污染，生产成本较高；生物法生产木糖醇不需要高温高压条件、易燃易爆氢气、污染环境的 镍催化剂和高纯度的木糖等，反应条件温和、安全节能且环境友好，所以生物法转化生产木 糖醇越来越受到人们的重视。目前用于发酵法制备木糖醇的微生物几乎都是酵母菌，既有 自然菌种，也有基因工程菌。酵母菌作为木糖醇生产菌株有着自己的优势，比如能耐受较高 的糖浓度，对半纤维素水解液中的抑制因子抵抗性较强，等等。但是也存在不可回避的问 题，主要体现在：（1)目前主要产木糖醇的酵母是热带假丝酵母，其具有潜在的致病性，并 不适合食品的生产；（2)酵母本身所含有的木糖还原酶专一性较差，对木糖和阿拉伯糖都 有较高的催化效率，这样一来利用半纤维素水解液转化生产木糖醇的时候，必然会有大量 副产物阿拉伯糖醇的产生，导致下游分离困难，增加生产成本；（3)在利用其它重组酵母如 酿酒酵母生产木糖醇时，因为其没有专一性的木糖转运蛋白，木糖吸收利用较慢，所以生产 效率较低。这些原因造成了目前生物法生产木糖醇在成本上还难以实现规模化、产业化开 发与应用。大肠杆菌作为生产各种高附加值化学品的理想宿主，当前研宄最为透彻，基因背 景清楚，利用其构建基因工程菌有着得天独厚的条件，其有培养条件简单，生长速度快，基 因操作相比酵母较为简单，蛋白表达水平高等诸多优点，而且在安全性问题上美国FDA也 批准了以大肠杆菌K12为出发菌株的重组菌用于生物医药产品的生产。以大肠杆菌作为宿 主生产木糖醇已有报道，Zhao 等人（Zhao, H.，Nair，N. U.，Racine，M.，Woodyer，R.，2011. Production ofxylitol from a mixture ofhemicellulosic sugars. PCT/US201I/021277) 利用大肠杆菌工程菌株进行流加发酵时，利用160g木糖可产生156g木糖醇，浓度达到 136g/L，生产速率为1. 92g/L/h ;在利用脱毒后的半纤维素水解液进行发酵时，利用50. 6g 木糖可生产46g木糖醇，生产速率为0. 56g/L/h。
[0004] 目前采用大肠杆菌为宿主生产木糖醇的研宄才刚刚开始，相关的报道不多，研宄 也不够深入，该文献报道的研宄虽然已经是目前重组大肠杆菌生产木糖醇的最高水平，但 是还没有充分发挥大肠杆菌发酵生产木糖醇的潜力，其底物浓度、产物浓度及生产效率还 不能和酵母相媲美。虽然当前针对不同宿主，利用各种代谢工程手段显著提高了木糖醇的 得率和产率，但大肠杆菌作为宿主生产木糖醇还存在一些瓶颈。由于大肠杆菌基因操作简 便，商业化可供选择的表达载体众多，不同的启动子、不同拷贝数的复制子极大的方便了蛋 白在大肠杆菌内的表达；所以对于大肠杆菌的代谢工程策略，当前普遍采用的是利用质粒 作为表达载体。但是质粒的存在往往会导致过重的代谢负担、分离的不稳定性以及蛋白表 达的不可控性；同时为了维持菌株中质粒的稳定存在，通常需要添加抗生素，这不仅增加生 产成本，还会带来抗药性的问题，威胁人类健康。目前利用大肠杆菌生产木糖醇的研宄中， 基本都还是利用质粒作为表达载体，所以目的基因在宿主菌中遗传稳定性问题就显得特别 突出。
[0005] 当前在大肠杆菌中进行基因组整合，主要有同源重组，定点整合和转座酶介导的 重组。同源重组最常用的是Red/ET重组，但此技术在在进行每次整合时需要寻找合适的 重组位点，然后根据整合位点设计不同同源臂，比较耗时费力；并且随着目的基因长度的增 加，其重组效率会大幅下降。定点整合往往借助的是大肠杆菌内的噬菌体整合位点进行整 合，实现多拷贝整合比较困难。转座酶介导的重组需要利用转座酶对目的基因进行处理，然 后进行随机的整合，实验操作较为繁琐，且不可进行多拷贝整合。最近有研宄者利用FRT位 点作为整合位点，进行多拷贝整合，此方法较为简便，但是抗性基因却无法删掉，增加了细 胞的代谢负担并可能带来生物安全性问题。所以，开发一种安全简便的大肠杆菌基因组整 合方法显得尤为重要。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种大肠杆菌基因组整合载体、基因工程菌以及在生产木糖醇中的 应用，该整合载体可以多拷贝整合到大肠杆菌基因组中，整合方法简单且遗传稳定。
[0007] -种大肠杆菌基因组的整合载体，包括复制子、表达原件、目的基因、抗性基因和 整合位点，所述的整合位点为IS序列。
[0008] IS序列作为最简单的转座元件，是很多细菌染色体的正常组成成分，特别是大肠 杆菌，其含有多种常见的IS序列，且拷贝数较多。以IS序列作为同源序列实现整合载体与 大肠杆菌基因组的重组，通过常规的整合技术，就可以使整合载体多拷贝整合到大肠杆菌 基因组中，方法简单易行，且整合到基因组上的目的基因遗传稳定。
[0009] 大肠杆菌中常见的IS序列有IS1、IS2、IS3、IS4、IS5等，不同大肠杆菌所含 有的IS序列拷贝数不同，同源序列长度也不相同，而拷贝数越多，同源序列较长，目的 基因整合的拷贝数也越多，概率也会越大，上述IS序列中，IS1的拷贝数为10左右同源 序列347-504bp，IS2的拷贝数为8左右，同源序列407-411bp，IS3的拷贝数为2左右， 1293-1329bp，IS4的拷贝数为6左右，同源序列646-867bp，IS5的拷贝数为12左右，同源 序列1000-1017bp。因此作为优选，选择IS5序列作为整合位点可以增加目的基因的拷贝 数。
[0010] 整合载体使用R6K复制子，其只有在表达Y蛋白的宿主菌中才能复制扩增，在普 通菌株中只有整合至基因组中才能在有抗性的培养基上生长；因此作为优选，所述的复制 子为R6K复制子。
[0011] 抗性基因两端含有FRT位点，通过FLP重组酶可将菌体携带的抗性基因删除，在减 轻菌体代谢负担的同时消除抗生素抗性基因流失到自然带来的抗药性问题。
[0012] 整合载体中的其他结构，如启动子、终止子、多克隆位点和RBS位点，可以根据目 的基因类型进行选择；抗性基因的类型也可根据研宄目的来确定。具体地，作为优选，所述 整合载体的碱基序列如SEQ ID No. 2所示。
[0013] 本发明还提供了一种基因工程菌，该基因工程菌包括宿主细胞大肠杆菌以及转入 大肠杆菌基因组的上述整合载体。所述的大肠杆菌优选为HK401。作为优选，大肠杆菌基 因组中，所述整合载体存在若干拷贝，以提高基因工程菌目的蛋白的表达量。但是需要指出 的是，以整合载体中的带FRT位点的抗性基因片段可以在整合至大肠杆菌基因组后进行敲 除，可以减轻大肠杆菌的代谢负担，并消除其潜在的生物安全性问题。
[0014] 本发明又进一步提供了所述的基因工程菌在生产木糖醇中的应用。该基因工程菌 基因组中整合的目的基因为木糖还原酶基因（简称XR基因），表达木糖还原酶。本发明选 用了碱基序列如SEQ ID No. 1所示的木糖还原酶基因，该基因能在30°C的较高温度下获得 高效表达，并且几乎没有包涵体产生。
[0015] 木糖还原酶基因的启动子可以采用Trc、pBAD和P43,针对上述碱基序列的木糖还 原酶基因，实验表明，含启动子P43的表达载体转化大肠杆菌后得到的基因工程菌在木糖 醇生产中的生产效率更高，并且不需要昂贵的诱导剂，所以，优选组成型的P43启动子。
[0016] 另外，实验表明，整合载体在大肠杆菌基因组中的拷贝数会影响木糖醇的生产效 率，但是，拷贝数达到一定数值后，木糖醇的生产效率趋于稳定。因此采用IS5序列作为整 合位点时，整合载体的拷贝数量为1~6，其中，优选拷贝数为5。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0018] (1)本发明以大肠杆菌基因组中的拷贝数较多的IS序列作为整合位点，进行载体 构建与基因组的整合，不仅整合方法简单，而且整合到基因组上的目的基因遗传稳定，既解 决了质粒作为表达载体时，工程菌代谢负担重、分离不稳定和蛋白表达不可控的问题，又简 化了现有的整合技术，解决了现有整合技术多拷贝整合耗时费力，筛选标记无法删除等问 题。
[0019] (2)本发明将组成型启动子P43与木糖还原酶基因进行连接，得到表达载体转入 宿主细胞后，获得的基因工程菌木糖还原酶能在30°C的较高温度下获得高效表达，并且几 乎无包涵体产生，且木糖还原酶的表达不需要添加诱导剂。
[0020] (3)本发明基因工程菌中目的基因整合进基因组后，不存在质粒分离不稳定的问 题，也不需要添加抗生素，在降低生产成本的同时，减少了抗药性的问题，并且其表达不需 要诱导剂，进一步降低生产成本。
【附图说明】
[0021] 图1为重组质粒pTrc99a-kan-xr6600的图谱。
[0022] 图2为重组质粒pBAD24M-XR的图谱。
[0023] 图3为重组质粒p⑶F43的图谱。
[0024] 图4为重