一种获得抗白粉病小麦的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种获得抗白粉病小麦的方法。
【背景技术】
[0002] 小麦是一种在世界各地广泛种植的禾本科植物，起源于中东新月沃土（Levant) 地区，是世界上最早栽培的农作物之一。小麦是一种温带长日照植物，适应范围较广，自北 纬17° -50°，从平原到海拔约4000m的高原（如中国西藏）均有种植。2010年，小麦是世 界上总产量位居第二的粮食作物（6. 51亿吨），仅次于玉米（8. 44亿吨）。全世界有43个 国家，有35% -40 %的人口以小麦为主要粮食。据联合国粮农组织2004年统计，全世界小 麦收获面积32. 36亿亩，单产193. 8千克/亩，总产6. 27亿吨。
[0003] 小麦的颖果是人类的主食之一，磨成面粉后可制作面包、馒头、饼干、面条等食物， 发酵后可制成啤酒、酒精、伏特加或生质燃料。小麦富含淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质、钙、铁、 硫胺素、核黄素、烟酸、维生素A及维生素C等。
[0004] 小麦白粉病是一种世界性病害，在各主要产麦国均有分布，我国山东沿海、四川、 贵州、云南发生普遍，危害严重。近年来该病在东北、华北、西北麦区，亦有日趋严重之势。 该病可侵害小麦植株地上部各器官，但以叶片和叶鞘为主，发病重时颖壳和芒也受害。近年 来，由于品种、栽培制度、肥水、气候条件的影响，白粉病大量发生，导致小麦叶片早枯、成穗 率减少、千粒重下降，严重影响了小麦的品质与产量。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种获得抗白粉病小麦的方法。
[0006] 本发明提供的获得抗白粉病小麦的方法，包括如下步骤：敲除出发小麦中的ML0 基因，得到抗白粉病小麦。
[0007] 所述抗白粉病小麦为所述ML0基因被敲除的纯合株。
[0008] 所述ML0基因为TaML〇-Al基因、TaML〇-Bl基因和TaML〇-Dl基因；
[0009] 所述TaML〇-Al基因编码如下（a)或（b) : (a)由序列表中序列4所示的氨基酸序 列组成的蛋白质；(b)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列4衍生的蛋白质；
[0010] 所述TaML〇-Bl基因编码如下（C)或（d) : (C)由序列表中序列5所示的氨基酸序 列组成的蛋白质；（d)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列5衍生的蛋白质；
[0011] 所述TaML〇-Dl基因编码如下（e)或（f) : (e)由序列表中序列6所示的氨基酸序 列组成的蛋白质；（f)将序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列6衍生的蛋白质。
[0012] 所述TaML〇-lA基因为如下（1)或（2)或⑶的DNA分子：⑴编码区如序列表的 序列1所示的DNA分子；（2)在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病 抗性相关蛋白的DNA分子；（3)与（1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码植 物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；
[0013] 所述TaML〇-Bl基因为如下⑷或（5)或（6)的DNA分子：(4)编码区如序列表的 序列2所示的DNA分子；（5)在严格条件下与（4)限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病 抗性相关蛋白的DNA分子；(6)与（4)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码植 物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；
[0014] 所述TaML〇-Dl基因为如下（7)或⑶或（9)的DNA分子：（7)编码区如序列表的 序列3所示的DNA分子；（8)在严格条件下与（7)限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病 抗性相关蛋白的DNA分子；(9)与（7)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码植 物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子。
[0015] 所述"敲除出发小麦中的ML0基因"是通过在所述ML0基因上进行定点敲除实现 的。可分别对所述TaML〇-Al基因、所述TaML〇-Bl基因和所述TaML〇-Dl基因进行定点敲除 (即3对3的定点敲除）。由于所述TaML〇-Al基因、所述TaML〇-Bl基因和所述TaML〇-Dl 基因的同源性很高，也可以选择它们的保守区域进行定点敲除（即1对3的定点敲除）。 [0016] 所述定点敲除的靶序列可位于所述ML0基因的第二个外显子的保守区。
[0017] 对于所述TaML〇-Al基因来说，定点敲除的靶序列具体如下：
[0018] TaML〇-A 基因：|TCGCTGCTGCTCGCCGT[ cacgcaRRacccaatctc jCGGGATATGCATCTCCCAj；
[0019] 对于所述TaML〇-Bl基因来说，定点敲除的靶序列具体如下：
[0020] TaML〇-B 基因：TCGCTGCTGCTCGCCGT； Racgcaggaccccatctc ；CGGGATATGCATCTCCGA：
[0021] 对于所述TaML〇-Dl基因来说，定点敲除的靶序列具体如下：
[0022] TaML〇-D 基因：|tCGC]'GCTGCTCGCCGT|; gacgcaggacccaatctcjCGGGATATGCATCTCCGA|。
[0023] 所述定点敲除的实现方式为：基因组定点编辑技术。所述基因组定点编辑技术为 锌指核酸酶技术（ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶技术（TALENs)或CRISPR/Cas9系 统。所述基因组定点编辑技术为转录激活子样效应因子核酸酶技术。
[0024] 所述定点敲除是借助TAL-ML0-L蛋白和TAL-ML0-R蛋白实现的；所述TAL-ML0-L 蛋白包括两个功能区段，即与靶序列上游部分核苷酸特异结合的TAL-L片段和EL突变型 Fok I核酸内切酶；所述TAL-ML0-R蛋白包括两个功能区段，即与靶序列下游部分核苷酸特 异结合的TAL-R片段和KK突变型Fok I核酸内切酶。
[0025] 所述TAL-L片段如序列表的序列12自N末端第138-681位氨基酸残基所示；所述 EL突变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12自N末端第733-933位氨基酸残基所示； 所述TAL-R片段如序列表的序列12自N末端第1130-1707位氨基酸残基所示；所述KK突 变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12自N末端第1759-1954位氨基酸残基所示。
[0026] 所述TAL-ML0-L蛋白自上游至下游依次包括如下元件：N端片段、所述TAL-L片 段、C端片段和所述EL突变型Fok I核酸内切酶；
[0027] 所述TAL-ML0-R蛋白自上游至下游依次包括如下元件：所述N端片段、所述TAL-R 片段、所述C端片段和所述KK突变型Fok I核酸内切酶；
[0028] 所述N端片段如序列表的序列12自N末端第1-136位氨基酸残基所示；所述C端 片段如序列表的序列12自N末端第684-730位氨基酸残基所示。
[0029] 所述TAL-ML0-L蛋白如序列表的序列12自N末端第1-950位氨基酸残基所示；所 述TAL-ML0-R蛋白如序列表的序列12自N末端第951-1954位氨基酸残基所示。
[0030] 所述定点敲除是通过导入重组载体实现的。所述重组载体为含有特异融合基因 的质粒。所述特异融合基因包括区段甲和区段乙；所述区段甲自上游至下游依次包括如 下元件：N端片段的编码区、TAL-L片段的编码区、C端片段的编码区和EL突变型Fok I 核酸内切酶的编码区；所述区段乙自上游至下游依次包括如下元件：所述N端片段的编码 区、TAL-R片段的编码区、所述C端片段的编码区和KK突变型Fok I核酸内切酶的编码 区；所述区段甲和所述区段乙之间具有T2A片段；所述TAL-L片段如序列表的序列12自N 末端第138-681位氨基酸残基所示；所述EL突变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12 自N末端第733-933位氨基酸残基所示；所述TAL-R片段如序列表的序列12自N末端第 1130-1707位氨基酸残基所示；所述KK突变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12自N 末端第1759-1954位氨基酸残基所示；所述N端片段如序列表的序列12自N末端第1-136 位氨基酸残基所示；所述C端片段如序列表的序列12自N末端第684-730位氨基酸残基 所示；所述T2A片段如序列表的序列12自N末端第934-951位氨基酸残基所示。所述重 组载体具体为将序列10所示双链DNA中的attLl位点和attL2位点之间的部分取代重组 质粒pYPOlO中序列7所示双链DNA分子中的attRl位点和attR2位点之间的部分得到的 质粒PYP010-T-ML0。所述重组质粒pYPOlO为将序列表的序列7所示的双链DNA分子插入 PJIT163载体的Kpnl和EcoRV酶切位点之间得到的重组质粒。
[0031] 本发明还保护一种融合基因，包括区段甲和区段乙；所述区段甲自上游至下游依 次包括如下元件：N端片段的编码区、TAL-L片段的编码区、C端片段的编码区和EL突变型 Fok I核酸内切酶的编码区；所述区段乙自上游至下游依次包括如下元件：所述N端片段的 编码区、TAL-R片段的编码区、所述C端片段的编码区和KK突变型Fok I核酸内切酶的编 码区；所述区段甲和所述区段乙之间具有T2A片段；所述TAL-L片段如序列表的序列12自 N末端第138-681位氨基酸残基所示；所述EL突变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12 自N末端第733-933位氨基酸残基所示；所述TAL-R片段如序列表的序列12自N末端第 1130-1707位氨基酸残基所示；所述KK突变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12自N 末端第1759-1954位氨基酸残基所示；所述N端片段如序列表的序列12自N末端第1-136 位氨基酸残基所示；所述C端片段如序列表的序列12自N末端第684-730位氨基酸残基所 示；所述T2A片段如序列表的序列12自N末端第934-951位氨基酸残基所示。
[0032] 含有所述融合基因的重组载体也属于本发明的