通过单链扩增和测序对单个细胞进行精确基因组测序的制作方法
【专利说明】通过单链扩增和测序对单个细胞进行精确基因组测序
[0001]关于联邦资助的研发的申明
[0002]本发明是在政府支持下获得美国国立卫生研宄院的GM097253和HG00550资助而完成的。政府对本发明拥有一定的权利。
[0003]相关申请的交叉引用
[0004]本申请要求2012年9月12日递交的美国临时申请第61/700，276号的权益，其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
[0005]本文的实施方案总体涉及用于对基因组核酸进行测序(包括对单个细胞的基因组核酸进行测序)的方法和装置。
[0006]发明背景
[0007]由Luria和Delbruck在他们的经典波动测试(Fluctuat1n Test)中开创了突变率的间接测量(Luria and Delbruck 1943)。通过量化显示表型改变的细胞数量来测量体细胞突变的概念被延伸至人类细胞，采用诸如HLA、HPRT或TK的基因。Albertini etal.1990，其全部公开内容通过引用并入本文。针对可以制备其转基因后代的模式生物如小鼠或苍蝇开发了 IacZ报告子测定法(Garcia et al.2007，其全部公开内容通过引用并入本文)。这样的间接测定法通常假定突变的外显率为恒定水平，这可能是有问题的。此外，基于在整个基因组中具有恒定突变率的过于简单的假设，在千碱基大小的基因座中突变率的间接测量被外推到整个基因组。这些局限呼唤在人类细胞中全基因组范围内直接测量突变。最近在人类中直接测量生殖细胞系(germline)突变率(Roach et al.2010，其全部公开内容通过引用并入本文)，然而在Luria-Delbruck实验之后近80年内全基因组范围内体细胞突变率的直接测量仍然有待证实。
[0008]在DNA测序技术中的迅速发展已经使得能够对许多生物进行常规从头(de novo)测序以及对人类个体或人类癌症进行再测序(re-sequencing)。单个细胞测序实验已经被描述于 Marcy et al.2007 和 Fan et al.Nature B1technology, 2011，29:51 - 57 中，其全部公开内容通过引用并入本文。
[0009]发明概述
[0010]本发明的一些方面提供了包括用于对单个细胞的基因组核酸进行测序的方法。所述方法包括:分离单个细胞的多个双链核酸，其中所述多个中每个双链核酸包含核酸第一链和核酸第二链，并且其中所述核酸第一链和核酸第二链彼此互补；将所述多个双链核酸中每个双链核酸的所述核酸第二链与所述核酸第一链分离；将所述多个双链核酸的所述第一链和第二链置于多个溶液中，其中所述多个溶液中每一个与每个其它溶液分开，并且其中在每个溶液中的链数量基本上类似；以及对每条链进行测序。在一些实施方案中，所述双链核酸包含染色体的部分。在一些实施方案中，所述双链核酸包含染色体片段的部分。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有大约1nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有大约4nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有大约2nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有大约Inl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有大约0.4nl或更少的体积。在这些实施方案的一些方面，测序包含小于大约112个中I个的错误率。在这些实施方案的一些方面，测序包含小于大约1ltl个中I个的错误率。在一些实施方案中，所述方法包括扩增每条链。在一些实施方案中，在测序之前将每条链在所述多个溶液之一中进行扩增。在一些实施方案中，扩增每条链包括多重置换扩增。在一些实施方案中，每条链被扩增至不超过大约10，000倍的幅度。在一些实施方案中，每条链被扩增至不超过大约1000倍的幅度。在一些实施方案中，每条链扩增不超过大约24小时。在一些实施方案中，每条链扩增不超过大约10小时。在一些实施方案中，每条链扩增不超过大约5小时。在一些实施方案中，所述多个溶液包含至少大约48个溶液。在一些实施方案中，所述多个溶液包含至少大约24个溶液。在一些实施方案中，所述多个溶液被放置于微流控装置中。在一些实施方案中，所述微流控装置如本文所述。在一些实施方案中，双链核酸的第一链和第二链在分开的溶液环境中的可能性至少大约95%。在一些实施方案中，所述可能性是至少大约98%。在一些实施方案中，所述核酸包含DNA。在一些实施方案中，所述单个细胞包含神经元。
[0011]本发明的一些方面包括用于对核酸进行测序的微流控装置，所述装置包括:用于对核酸进行测序的微流控装置，所述装置包括:单个细胞捕获模块；被配置用于细胞裂解和核酸链分隔(partit1ning)的构件(member);以及多个室(chamber)。所述单个细胞捕获模块可与所述构件流体连通，并且其中所述构件与所述多个反应室流体连通。所述装置被配置为在所述多个室中基本上平均分配(distribute)多个被分隔的单链核酸。在一些实施方案中，所述构件包含旋转构件。在一些实施方案中，所述构件包含被动扩散膜。在一些实施方案中，所述双链核酸包含染色体的部分。在一些实施方案中，所述双链核酸包含染色体片段的部分。在一些实施方案中，所述多个室中每一个具有大约1nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个室中每一个具有大约4nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个室中每一个具有大约2nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个室中每一个具有大约Inl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个室中每一个具有大约0.4nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述装置的内表面涂有非粘性聚合物。在一些实施方案中，所述非粘性聚合物包含PEG。在一些实施方案中，所述多个室包含至少大约24个室。在一些实施方案中，所述多个室包含至少大约48个室。在一些实施方案中，所述多个室中每一个被配置用于多重置换扩增。在一些实施方案中，所述微流控装置被配置为自动捕获单个细胞、裂解所述细胞并将所述细胞的单链核酸基本上平均分配至所述多个室。在一些实施方案中，所述多个室中每一个被配置为将一定量的流体转移至用于测序文库制备的反应容器。
[0012]附图简述
[0013]图1A是根据本文一些实施方案的微流控芯片的示意图。
[0014]图1B是根据本文一些实施方案的用于单个细胞捕获、分隔和扩增的三个模块示意图。
[0015]图1C是表示用图1A中所示装置处理的单个小鼠胚胎成纤维细胞的读取深度值分布的一系列图。
[0016]图1D是表不对应于图1A不意图的装置的照片。
[0017]图2A是表示根据本文一些实施方案的微孔阵列设计的一系列照片。每个所示的孔直径100 μ m。
[0018]图2B是表示根据本文一些实施方案的通过显微操作进行单个大肠杆菌细胞的扩增子提取的一系列照片。
[0019]图2C是表示根据本文一些实施方案所获得的单个大肠杆菌测序文库的读取深度值分布的对数的图。所限制的扩增和本文所示的新文库制备方法的组合显著改善了均一性。
[0020]图2D是表示根据本文一些实施方案所获得的单个大肠杆菌测序文库的读取深度值分布的图。所限制的扩增和本文所示的新文库制备方法的组合显著改善了均一性。
[0021]图3是表示根据本文一些实施方案的智人染色体19的代表性单个2.5Mb片段测序的图。完整的智人染色体被根据本文一些实施方案的方法进行分离、均一扩增和测序。值得注意的是，图3包括两张图，图31，代表图的左侧以及图32代表右侧。
[0022]图4是表示根据本文一些实施方案对单个细胞的双链核酸进行测序的方法的流程图。
[0023]发明详述
[0024]一些实施方案包括被本文称为 SISSOR(SIngle_Stranded Sequencing usingmicrOfluidic Reactors，采用微流控反应器的单链测序)的用于单个哺乳动物细胞进行精确基因组测序的技术。单个细胞中双链核酸分子的两条互补链可以被分离以用于独立的扩增和测序，并且来自该沃森和克里克链的冗余测序数据可以被用于从测序错误中区分每个基因组几十个真正的突变，其有可能成为数以千计至数以万计的数字。在一些实施方案中，SISSOR的精确率比现有方法高10，000多倍。一些实施方案包括通过微流控装置实现SISSOR以实现三个主要功能:(I)单个细胞捕获，⑵裂解和单链DNA分隔，以及(3)单个分子全基因组扩增。
[0025]以足以检测稀有体细胞点突变的精确度在单个细胞中对哺乳动物大小的基因组进行测序可能是主要的挑战。这样的测序之前极其困难是因为:(i)哺乳动物基因组大(?109bps)而体细胞突变率非常低(每次细胞分裂?10_9bp)，需要具有极其低的假阳性率(?10_1(1)的方法；(ii)来自单个细胞的DNA的体外扩增具有10_6或比突变率高1，000倍的错误率，这是单个细胞测序的致命弱点:仅由聚合酶错误所产生的假阳性率就大大超过真正的突变了。
[0026]最近报道了许多对癌症单个细胞测序的研宄，这在社会上产生了极大的兴奋。然而，这些现有方法只能检测大染色体区域的获得或丢失(Navin et al.2011)，或者错误率为10_5的单个核苷酸变化(Hou et al.2012 ；Xu et al.2012)。癌症基因组还由于较高的突变率以及因此对测序错误的更低要求而代表了更加容易获得的成果。对于有限数量的体细胞类型，人们可以从稀释的单个细胞衍生出用于常规测序的克隆群体。但是，如在最近的研宄中观察到的，体外克隆扩增可能引入另外的突变，并导致过高估计的突变率(Gore etal.2011)。在一个细胞分裂之后，大部分人类细胞类型中体细胞突变率的直接测量会涉及相对于这些现有技术改善?100，000倍的精确度。
[0027]用于精确测序的分离单个细胞的两条互补链的想法不容易实现。细胞中每个单个DNA分子会以所有的方式进入测序仪并产生可用的数据进行纠错。就申请人所能知道的，所有之前的全基因组扩增方法具有高扩增偏差，使得即使两条DNA链被分开了，这些之前的方法不能从两条链获得测序数据用于错误识别。尽管在过去十年中就改善全基因组扩增方法付出许多努力，直到本公开内容之前，扩增偏差已经成为单个细胞全基因组扩增中的主要问题。除了偏差的扩增之外，DNA片段还能够非特异性结合各种表面(移液器枪头、PCR管等)而丢失。当只有一个模板分子用于开始的时候，核酸分子的丢失代表了另一个挑战。
[0028]在最近的关于人诱导胚胎干细胞中体细胞突变的研宄中，发现至少一半的突变以各种频率水平预先存在于该体细胞的前体细胞中，一些频率低至10，000个细胞中有五个(Gore et al.(2011)Nature 471:63-67)。一个接下来的假设是体细胞群中每个单个细胞携带大量的专有突变，并且这些突变在重新编程和克隆扩增之后变成固定的(有或没有选择)。为了检验该假设，我们可以直接对单个的前体细胞进行测序并且鉴定以10_8或更低的频率发生的体细胞突变，这被认为用任何现有的技术是不可能。
[0029]另一个观察是对于神经元的核基因组来说，哺乳动物脑是镶嵌的，这是由于至少三种机制方面:非整倍体、LINE-1反转录转座子和其它DNA含量的变化。另外，TSRI的Jerold Chun的组发现的证据是，在特定皮层区域中神经元的体细胞基因组变化与许多脑疾病有关，包括阿尔茨海默氏症和自闭症谱系障碍。尽管所有这些观察结果所产生的兴奋，充分表征单个神经元中基因组多样性的程度之前被认为是不可能的，这源于与对单个细胞进行测序相同的技术局限。
[0030]在一些实施方案中，提供的方法和微流控装置提供高精确度(错误率?10_1CI)、单个核苷酸的分辨率、远程(long-range)单倍型信息、不需要稀释的单个细胞克隆扩增、均一无偏差的DNA扩增和自动化选项。
[0031]根据本文一些实施方案的方法和微流控装置可以被用于各种应用，包括但不限于:癌症中稀有突变的早期检测、单个体细胞中稀有基