一种连续制备萝卜硫素的方法
【专利说明】
一、技术领域
[0001]本发明属于天然活性物质分离纯化技术领域，具体涉及萝卜硫素的制备方法。
二、【背景技术】
[0002]流行病学及药理学等的研宄表明，十字花科蔬菜含有阻止或减缓癌症发展的活性成分，例如西兰花，是十字花科芸苔属甘蓝种中以绿色花球为产品的一个变种，其种子中含有丰富的硫代葡萄糖苷。硫代葡萄糖苷在硫代葡萄糖苷酶或酸的催化下，生成萝卜硫素等异硫氰酸盐。萝卜硫素是迄今为止蔬菜中发现的最强抗癌成分之一，它可诱导机体产生Phase II型解毒酶-谷胱甘肽转移酶和醌还原酶，该酶能解除亲电子致癌物质的毒性作用，干扰其对DNA的结合及破坏，同时抑制Phase I酶的产生，从而影响癌的形成。所以，从十字花科蔬菜中分离纯化萝卜硫素具有重要的科学价值和广阔的市场前景。
[0003]目前制备萝卜硫素的方法有:1.申请号为201210414994.2、名称为“一种高纯度萝卜硫素的提取纯化方法”的发明专利，该专利公开的方法是以干燥西兰花种子粉加水水解，获得固液混合物；再向该混合物中加入无水乙醇，进行超声浸提、抽滤或双层纱布过滤，获得滤液；接着对滤液进行真空浓缩，蒸发乙醇并获得浓缩液；浓缩液进行大孔树脂柱层析及用乙醇水溶液进行梯度洗脱，获得含萝卜硫素洗脱液并继续进行氧化铝柱层析、浓缩，获得萝卜硫素浸膏粗品；最后将获得的粗品加水溶解后用极性溶剂萃取，收集有机层冰并真空浓缩获得油状浸膏，即高纯萝卜硫素。该方法存在的主要问题是:①未对种子进行脱月旨，由于油脂的阻挡，西兰花种子中的硫代葡萄糖苷和硫代葡萄糖苷酶难以有效接触，导致萝卜硫素的生成率低；②未对水解液进行pH、温度条件的控制，硫代葡萄糖苷酶对硫代葡萄糖苷的水解处于非优化环境，致使大量杂质生成，分离纯化困难且成本高；③用乙酸乙酯萃取的选择度低，不仅可萃取萝卜硫素，还可萃取其类似物，且在较高温度下真空浓缩，萝卜硫素不稳定，易重排生成多种异构体，产品纯度低；④无水乙醇回收率低，生产成本高，缺乏竞争力。2.申请号为201310408729.8、名称为“一种从西兰花中提取萝卜硫素的方法”的发明专利，其公开的方法为:将新鲜西兰花的食用部分花枝脱水后烘至恒重并粉碎，获得西兰花干粉；将新收获的芥籽粉碎提取，再真空抽滤除杂，得到粗酶液；向所述西兰花干粉中加入所述粗酶液，搅拌均匀，经酶解、超声波振荡提取并过筛及真空抽滤除渣、真空浓缩后获得萝卜硫素粗提水溶液；向萝卜硫素粗提水溶液中加入乙酸乙酯萃取、收集乙酸乙酯相并真空浓缩成膏状萝卜硫素粗提物；将膏状萝卜硫素粗提物经冷冻干燥至恒重，即得纯度为1%?15%的萝卜硫素粗品。该方法存在的主要问题有:①新鲜西兰花食用部分含水量高达90%左右，进行干燥耗能极高且在高温环境下萝卜硫素快速分解；②新鲜芥籽受季节控制，难以常年生产且粗酶液中杂质和杂酶均多，水解生成的杂质多，萝卜硫素生成率低；③因为萝卜硫素在水溶液中的稳定时间仅约90分钟，而水解时间长达8小时，在此期间萝卜硫素大量重排或异构化，导致萝卜硫素生成率极低。由此可知，上述己公开发明专利存在着萝卜硫素生成率极低、生产时间长、能耗高、产品纯度低、成本高等共同缺陷，有必要进一步研发新方法，提升萝卜硫素生成率和纯度、降低生产成本。三、
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有制备萝卜硫素的方法的不足之处，提供一种以萝卜种子为原料，制备高纯度萝卜硫素的方法。该方法通过原料脱脂、对水解PH值、酶解温度、酶解时间的调节及外加萝卜硫苷等方式，实现萝卜硫素的连续、规模化和高纯度制备。该方法具有充分利用资源，萝卜硫素生成率高、可操作性强、可自动化连续化生产、产品纯度高达98%以上，绿色无污染等特点。
[0005]本发明的原理是:萝卜细胞既含有萝卜硫苷，又含有硫代葡萄糖苷酶，萝卜种子中萝卜硫苷在特定条件下可被硫代葡萄糖苷酶水解，生成萝卜硫素；萝卜种子油脂含量高达30%以上，由于油脂不溶于水，而萝卜硫苷和硫代葡萄糖苷酶均为水溶性物质，两类物质互不相溶。因此，大量油脂存在会干扰萝卜硫苷和硫代葡萄糖苷酶的有效接触，进而影响硫代葡萄糖苷酶对萝卜硫苷的水解，故必须进行脱脂处理；完整萝卜籽不利于溶剂进出，影响脱脂效率，所以使用中药破碎机刀片旋转进行破碎处理，制备成萝卜籽粉；萝卜籽油脂易溶于正己烷，以正己烷为溶剂，在适当条件下对其粉末进行浸取，即可获得脱脂萝卜籽粉；在适当条件下，纯水以一定流速通过以脱脂萝卜籽粉装配出的萝卜硫苷连续水解柱时，脱脂萝卜籽粉中的萝卜硫苷溶于其中，形成萝卜硫苷水溶液；由于自身含有的萝卜硫苷量少，硫代葡萄糖苷酶将其水解完后尚存活力，因而，可继续水解外加的萝卜硫苷。当外加萝卜硫苷水溶液中的萝卜硫苷扩散至硫代葡萄糖苷酶附近，也被该酶水解成萝卜硫素，从而实现对萝卜硫苷的连续化水解；非极性大孔吸附树脂在水溶液中可选择性吸附萝卜硫素等化合物，以萝卜硫苷连续水解柱的出液口串联大孔吸附树脂柱的进液口，组成萝卜硫苷连续水解-分离耦合系统；水解生成的萝卜硫素从萝卜硫苷连续水解柱流出便进入大孔吸附树脂柱进行吸附分离，极大缩短了萝卜硫素在水中的停留时间，因而显著降低了萝卜硫素的重排和异构化反应，增加了萝卜硫素生成率；萝卜硫素结构独特，与大孔吸附树脂形成特殊的相互作用，用特殊洗脱剂洗脱，就实现了对该化合物的有效分离；制备型高效液相色谱法是一种使用高压、大流量液体输送系统在高分辨率、大内径、高载量分离柱上进行样品高纯度分离的液相色谱制备方法，由于制备型液相色谱的塔板数极高，分离效率高，可将其它杂质一一分离，制备出高纯度的萝卜硫素；冷冻干燥是在较低的温度条件及环境下把含有大量水分的萝卜硫素，预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸汽直接从固体中升华出来，当98%以上的水分被脱除即获得能长期保存的高纯度萝卜硫素。
[0006]本发明的目的是这样实现的:一种连续制备萝卜硫素的方法，以萝卜籽为原料，经历制备脱脂萝卜籽粉、装配萝卜硫苷连续水解柱、装配萝卜硫苷连续水解分离系统、制备萝卜硫苷液、制备富集萝卜硫素大孔吸附树脂柱、制备萝卜硫素初级浓缩液及制备高纯度萝卜硫素步骤，制备出纯度高达98%以上的萝卜硫素。其具体的工艺步骤如下:
[0007]1.制备脱脂萝卜籽粉
[0008]取风干后含水量低于8%的萝卜籽，先用中药粉碎机粉碎，再按照萝卜籽粉质量(kg):正己烷体积(L)之比为1: 4?8的比例，先将萝卜籽粉置于罐式浸出器中，泵入正己烷，控制温度为20?40°C，进行第一次搅拌脱脂30?60min。第一次搅拌脱脂完成后，放出溶解有萝卜籽油脂的正己烷，再泵入正己烷进行第二次搅拌脱脂，第二次搅拌脱脂泵入的正己烷体积及脱脂温度和时间均与第一次搅拌脱脂相同。第二次搅拌脱脂完成后，放出溶解有萝卜籽油脂的正己烷。第二次搅拌脱脂后的脱脂萝卜籽渣，在搅拌下通入表压为0.1?0.4MPa、流速为5?15m/s的压缩空气，压出脱脂萝卜籽粉渣中残余的正己烷，直至无正己烷滴出时止。分别收集第一次、第二次搅拌脱脂放出、压缩空气压出的溶解有萝卜籽油脂的正己烷及含正己烷的压缩空气，对收集的含正己烷的压缩空气，送入冷凝器中进行冷凝处理，回收正己烷；对于第一次、第二次搅拌脱脂放出及压缩空气压出的溶解有萝卜籽油脂的正己烷进行合并，再送至脱溶剂釜进行脱正己烷处理，回收正己烷并获得粗制萝卜籽油；对获得的粗制萝卜籽油，进行精炼处理，制备出精炼食用萝卜籽油；对于收集的脱脂萝卜籽粉，用于制备萝卜硫苷连续水解柱或制备萝卜硫苷液。
[0009]2.装配萝卜硫苷连续水解柱
[0010]第I步完成后，将第I步制备的脱脂萝卜籽粉用20?60目的不锈钢筛网进行筛分，分别收集过筛物和未过筛物。对于收集的未过筛物，将其装填于内径为100?200_、高度为600?1200_的自制不锈钢夹层水解柱中，直至装填高度达到500?1000_时，再连接好转换接头，装配出萝卜硫苷连续水解柱，用于连续水解萝卜硫苷；对于收集的过筛物，即为脱脂萝卜籽细粉，用于制备萝卜硫苷液。
[0011 ] 3.装配萝卜硫苷连续水解分离系统
[0012]第2步完成后，先按照HPD-700或HPD-600大孔吸附树脂体积(L):脱脂萝卜籽粉质量(kg)为1: 20?30的比例，将新购HPD-700或HPD-600大孔吸附树脂装入内径为50?100mm、高度为500?600mm的不锈钢层析柱，直至装填高度达到500?600mm时，连接好转换接头，就装配出大孔吸附树脂层析柱；接着按照使用说明书的要求，先向大孔吸附树脂层析柱中泵入乙醇，直至泵入的乙醇完全浸没大孔吸附树脂时止，接着浸泡4?6h，再泵出乙醇，洗涤至流出液中无紫外吸收，然后用纯水洗涤至无乙醇味时止。分别收集浸泡、洗涤大孔吸附树脂后的乙醇和用乙醇及纯水洗涤后的大孔吸附树脂层析柱。对收集的浸泡、洗涤大孔吸附树脂后的乙醇，进行蒸馏回收；对收集的先后用乙醇、纯水洗涤后的大孔吸附树脂层析柱，即为活化大孔吸附树脂层析柱。将收集的活化大孔吸附树脂层析柱的进液口与第2步装配出的萝卜硫苷连续水解柱出液口用管道连接，就装配出萝卜硫苷连续水解分离系统，用于连续水解萝卜硫苷，分离萝卜硫素。
[0013]4.制备萝卜硫苷液
[0014]第3步完成后，将第2步收集的脱脂萝卜籽细粉置于热风烘箱中，在85?100°C的温度下处理I?2h，进行硫代葡萄糖苷酶失活处理，失活处理完成后，按照硫代葡萄糖苷酶失活后的脱脂萝卜籽细粉质量(kg):甲醇体积(L)为1: 10?20的比例，把硫代葡萄糖苷酶失活后的脱脂萝