一种菌丝霉素突变体及其基因、制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，特别涉及一种菌丝霉素（Plectasin)的突变体多肽及 其基因、制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 寻找新型抗菌制剂已成为一个迫在眉睫的问题，防御素以其独特的抗菌机制，抗 菌谱广和不易产生耐药性以及来源安全等优点，日益受到人们的重视，成为传统抗生素的 理想替代品。2005 年，Mygind 等（Mygind PH，Fischer RL，Schnor;r KM, et al. Plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus [J]. Nature，2005, 437 (7061) : 975-980.)从腐生子囊菌中分离得到了菌丝霉素，被 认为是首例真菌防御素，继而引起了人们极大的关注。Schmitz J(Schmitz J, Holzgrabe U.Plectasin-a new peptide antibiotic with high therapeutic potential[J]. Pharm Unserer Zeit, 2010, 39(5) :336-338.)通过研究发现，菌丝霉素是通过干扰细菌细胞壁的 合成来抑制或杀死细菌，对革兰氏阳性菌抑菌效果明显。研究发现，菌丝霉素在生理条件下 就有很高的活性；血清稳定性好，半衰期可延长，不易刺激细胞产生炎症反应；对哺乳动物 细胞的毒害性小；最小抑菌浓度和最小杀菌浓度几乎相同，能快速杀灭细菌；与万古霉素 作用于细胞壁的方式不同，不会产生交叉耐药性，因此，菌丝霉素可以作为一种具有治疗革 兰氏阳性菌巨大潜能的小肽抗生素。本实验室（梁文，胡又佳，朱宝泉等.菌丝霉素的高 效表达、纯化及活性[J].中国医药工业杂志，2013, 44(1) :21-26.)在前期研究中成功构建 了一株菌丝霉素的表达载体PYG330,实现了菌丝霉素融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达， 但其抑菌活性还有待进一步的提高。
【发明内容】
[0003] 因此本发明要解决的技术问题就是：针对现有的菌丝霉素融合蛋白的抑菌活性较 低的缺陷，提供了 一种新的菌丝霉素突变体及其基因、制备方法和应用。
[0004] 为解决上述技术问题本发明所采用的技术方案之一为：一种菌丝霉素突变体，其 所述菌丝霉素突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示。
[0005] 本发明所述菌丝霉素突变体的氨基酸序列的制备方法为本领域常规制备方法，所 述菌丝霉素突变体的氨基酸序列的制备方法较佳地为通过表达分离纯化制备或者通过人 工合成氨基酸序列制备即得。本发明所述菌丝霉素突变体的氨基酸序列优选地为（如序列 表中SEQ ID NO:2所示）：
[0006] GFCGNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCDKGGFVCKCY。
[0007] 为解决上述技术问题本发明所采用的技术方案之二为：一种菌丝霉素突变体的编 码基因，其所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N〇:3所示。
[0008] 本发明所述菌丝霉素突变体的基因的核苷酸序列的制备方法为本领域常规制 备方法，所述菌丝霉素突变体的基因核苷酸序列的制备方法较佳地包括聚合酶链式反应 (PCR)扩增制备，或者人工合成该核苷酸序列制备即得，本发明所述菌丝霉素突变体的基因 的核苷酸序列优选地为（如序列表中SEQ ID NO: 3所示）：
[0009] 5 ' -GGTTTTGGTTGCAACGGTCCGTGGGATGAAGATGATATGCAGTGCCACAACCACTGCAAATCTATC AAAGGTTACAAAGGTGGTTACTGTGATAAAGGTG GTTTTGTTTGCAAATGTTAC-3'。
[0010] 为解决上述技术问题本发明所采用的技术方案之三为：一种菌丝霉素突变体融合 蛋白，其中所述菌丝霉素突变体融合蛋白氨基酸序列从N端到C端依次为：保护肽段氨基酸 序列，蛋白分离纯化标签氨基酸序列，蛋白酶的酶切位点氨基酸序列以及SEQ ID No:2所示 的氨基酸序列。
[0011] 本发明所述的菌丝霉素突变体的融合蛋白，是指在菌丝霉素突变体的氨基酸序列 的N端或C端添加一个或多个氨基酸残基的融合蛋白质。其中"多个"更佳地是指2~200 个氨基酸残基。所述氨基酸残基组成的肽段较佳地是保护肽，所述保护肽是指新生肽链N 端或C端的一段由多个氨基酸残基组成的肽段，该肽段的主要功能是降低菌丝霉素突变体 对表达菌株的细胞毒性，并提高宿主对菌丝霉素突变体的表达效率。保护肽段与目的菌丝 霉素突变体形成的菌丝霉素融合蛋白经表达纯化后，由特定的蛋白酶切割后经分离纯化步 骤去除保护肽片段和蛋白酶，即可得到具有生物活性的菌丝霉素突变体。
[0012] 本发明所述菌丝霉素突变体融合蛋白氨基酸序列较佳地包括蛋白分离纯化标签， 所述蛋白分离纯化标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的多肽或蛋 白质，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和分离纯化等目的。其中所述蛋白分离纯化标签 较佳地包括：His tag、FLAG tag、MYC tag、SBP tag、CBP tag、GST tag、EGFP tag,更佳地 为His tag (组氨酸标签)。
[0013] 本发明所述蛋白酶的酶切位点为本领域常规使用的蛋白酶切位点，其中所述蛋白 酶酶切点较佳地为TEV酶识别位点，经TEV酶进行识别和切割，去除保护肽段和TEV酶，即 得到具有生物活性的菌丝霉素蛋白。
[0014] 本发明所述TEV酶切中的TEV蛋白酶（TEV Protease)是指来源于烟草蚀纹病毒 (TEV)的Nla蛋白酶经改进后的28kDa的蛋白酶，经过设计后与天然TEV蛋白酶相比其稳 定性更好。此蛋白酶被用来切除纯化后融合蛋白的亲和标签。TEV蛋白酶具有很强的位点 特异性，能够识别EXXYXQ(G/S)的七氨基酸序列，最普通的识别位点为ENLYFQG，其切割位 点在谷氨酰胺和甘氨酸或丝氨酸之间。蛋白酶在G/S(或ΡΓ)位点切割多种氨基酸序列， 为切割后C端融合部分提供一个想要的N端氨基酸。切割后也很容易利用其N端的HQ标 签进行TEV蛋白酶清除。也可以从固定在树脂上的融合蛋白切除掉目的蛋白。本发明所述 TEV酶活性较佳地为11. 5U/mg，所用TEV酶和底物菌丝霉素突变体融合蛋白的质量比较佳 地为0.125 : 1~2 : 1，更佳地为2 : 1。TEV蛋白酶在较宽的温度范围内都有很好的蛋 白酶活性，本发明所述TEV酶切的温度较佳地为4~37°C，更佳地为34°C ;TEV酶切时间较 佳地为0. 5~6小时，更佳地为2小时。
[0015] 本发明所述菌丝霉素突变体融合蛋白氨基酸序优选地为（如序列表中SEQ ID No:4所示）：
[0016] MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFffAEffCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAP KYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHM DSPDLGTDDDDKAMGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMSENLYFQGSGFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCDKGG FVCKCY。
[0017] 为解决上述技术问题本发明所采用的技术方案之四是：一种菌丝霉素突变体融合 蛋白的编码基因，其所述的菌丝霉素突变体的编码基因是编码本发明所述的菌丝霉素突变 体融合蛋白的基因。
[0018] 本发明根据已发表的plectasin在腐生子囊菌中的核苷酸序列（Per R Mygind，Rikke L Fischer，Kirk E Schnorr et al，Plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus[J]. Nature, 437 ( 13)， 0(^0^1^005:975-98()),再参照大肠杆菌密码子偏好性使用表，设计合成了表达菌丝霉素 并包括Hi s-tag和TEV酶酶切位点的菌丝霉素融合蛋白基因序列，本发明以该序列为模板， 采用易错PCR技术，得到一种表达菌丝霉素突变体融合蛋白的基因序列。
[0019] 本发明所述菌丝霉素突变体融合蛋白的编码基因核苷酸序列较佳地是由在上述 核苷酸序列中通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加核苷酸提供一个衍生的多聚核苷 酸并且同样能编码如本发明所述的融合蛋白的同系物基因。本发明所述菌丝霉素突变体融 合蛋白的编码基因的核苷酸序列优选