一种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的免疫荧光试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的免疫荧光试纸条及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED)是由冠状病毒科猪流行性腹 泻病毒引起的一种侵害猪肠道的急性传染病。能够引起各年龄的猪发生呕吐、腹泻和脱 水。各年龄猪均易感，尤其是对1周龄内的新生仔猪危害最大。新生仔猪的发病率可达 60%-100%，死亡率高达100%。导致仔猪的大批死亡，生猪出栏率下降，造成市场猪肉供应不 足，影响猪肉价格稳定。本病在欧洲和亚洲传播非常广泛，每年都会给一些国家和地区造成 严重的经济损失，给养猪业带来了巨大的危害。2013年和2014年PEDV分别席卷了美国和 加拿大的养猪业。加拿大食品检验局（CFIA)于2014年3月份发布公告认为血浆蛋白粉有 可能是猪流行性腹泻的罪魁祸首。因为仔猪饲料生产中会添加血浆蛋白粉，所以为PEDV的 大规模传播提供了潜在的机会。为了降低饲料中携带PEDV病原的风险，我们急需一种简单 快速的方法对原料中的PEDV病原进行检测，降低饲料携带病原的风险；同时对疾病做出早 期诊断，提前采取防控措施，也是降低养殖户因疾病带来的损失的最好途径。
[0003] 目前常用的检测PEDV的方法有病毒分离鉴定、RT-PCR、ELISA法、免疫荧光法（IF) 和胶体金。其中病毒分离鉴定、RT_PCR、ELISA法、免疫荧光法（IF)必须结合实验室方法进 行确诊，操作繁琐费时，需要专门的试验技术人员和仪器设备，只能用于实验室检测。不适 合于现场检测和基层兽医工作人员的使用。另外，由于PEDV可造成持续感染，这给PEDV的 临床检测带来了巨大的困难。
[0004] 关于PEDV的快速诊断试纸条我国目前还没有同类产品上市，市场上有韩国进口 的PEDV胶体金检测试纸条在销售，但其只能进行PEDV的定性不能定量，且成本过于昂贵， 普通养殖户使用不起；且其灵敏度不是很高。因此建立PEDV的快速检测方法，用于PEDV的 感染早期和现场快速检测，有利于对感染PEDV的母猪进行及时免疫，防止疾病的扩散，有 利于养猪业的健康发展；同时对饲料原料血浆蛋白的污染源进行质量控制，降低从饲料途 径造成PEDV流行的风险。以抗PEDV的纳米抗体研制PEDV病原的快速检测方法，在国内外 尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述存在的问题，本发明通过研宄，制备了一种特异性高、灵敏度高的纳 米抗体(抗PEDV单域抗体)，并基于此抗体制备了一种能够快速定量检测猪流行性腹泻病毒 的免疫荧光检测试纸条。
[0006] 本发明的目的在于提供一种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的免疫荧光试纸条。
[0007] 本发明所采取的技术方案是： 一种用于检测猪流行性腹泻病毒的单域抗体，其氨基酸序列为如SEQ ID NO :6所示。
[0008] -种用于检测猪流行性腹泻病毒的单域抗体，编码该单域抗体氨基酸序列的核苷 酸序列如SEQ ID NO :3所示。
[0009] -种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的免疫荧光试纸条，包含附着于底板上且 依次紧密相连的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫；所述结合垫上含有荧光微球标记的抗 PEDV单域抗体；所述层析膜上设置有一条检测线和一条质控线，检测线靠近结合垫，质控 线靠近吸水垫，检测线上包被有抗PEDV的多克隆抗体，质控线上包被有能与荧光微球标记 的抗PEDV单域抗体结合的蛋白； 其中所述的抗PEDV单域抗体为上述所述的单域抗体。
[0010] 进一步的，上述质控线上包被的能与荧光微球标记的抗PEDV单域抗体结合的蛋 白为兔抗双峰驼IgG。
[0011] 进一步的，上述样品垫为玻璃纤维膜。
[0012] 进一步的，上述层析膜为硝酸纤维素膜。
[0013] 进一步的，上述吸水垫为吸水纸。
[0014] 进一步的，上述质控线和检测线之间的距离为4. 5~5. 5mm。
[0015] 进一步的，上述质控线用0. 5~I. 5mg/mL兔抗双峰蛇IgG进行包被，用量为1 μι/ cm 〇
[0016] 进一步的，上述检测线用0. 8~I. 2 mg/mL抗PEDV多克隆抗体包被，用量为2μLν cm 〇
[0017] 本发明的有益效果是： 1)本发明制备的免疫荧光快速试纸技术是应用纳米荧光颗粒(荧光微球标记的PEDV 单域抗体)构建出一种可定性同时定量的快速检测试纸。操作者无需培训和专业知识，操作 简单，5~10分钟即可获得结果，若与荧光定量仪连用，可实现定量检测，同时该技术灵敏度 明显优于传统的胶体金检测试纸技术，具有广阔的市场前景。
[0018] 2)抗体作为免疫试纸条检测技术的核心部分，其特异性及亲和力决定了测定结果 的准确性和灵敏度。本发明采用了特定制备的高灵敏的、PEDV特异性的单域重链（VHH)抗 体，研制成检测PEDV病原的快速检测试纸，目前在国内外均未见报道。
【附图说明】
[0019] 图1为实施例1中RT-PCR扩增VHH基因片段的结果图； 图2为SDS-PAGE检测PEDV单域抗体的结果； 图3为PEDV免疫荧光快速检测试纸条的结构示意图，其中1为塑料底板，2为样品垫， 3为结合垫，4为硝酸纤维素膜，5为吸水纸，6为检测线T，7为质控线C。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1猪流行性腹泻病毒重链单域抗体的制备 1)动物免疫 在双峰驼颈背部皮下和双侧后腿皮下进行多点接种PEDV灭活疫苗。首次免疫剂量为 ImL/头，共2头；7天后二免，2 mL/头；之后间隔14天免疫一次，每次免疫4 mL，共免疫3 次，全程共免疫5次。最后一次免疫后7天采血500 mL分离淋巴细胞，提取总RNA进行下 一步实验。
[0021] 2)单域抗体库的构建 设计引物扩增VHH基因片段，通过前期大量实验研宄筛选出效果最好的引物，其序列 如下： VHH-F :5' - CCTTTCTATGCAGGCCCAGCCGGCCGCA-3'（SEQ ID NO :1); VHH-R:5' - GTTATTATTATTCAGATTATTATGCGGCC-3' （SEQ ID N0: