一种茵达霉素及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物制备技术领域，尤其涉及一种由链霉菌发酵产生的茵达霉素的 制备方法及其用途。
【背景技术】
[0002] 刺吸式口器害虫，例如蚜虫、叶螨、飞虱等。它们亲缘中的分类地位差别很大，但危 害方式十分相似。它们以细长针管状口器刺吸植物体表（包括叶、花、果、皮）中的营养汁 液，使细胞受到破坏，生长失去平衡，严重时植株停止生长，甚至全株萎蔫枯死。刺吸式口器 害虫大多体型较小，但繁殖速度快，数量极多，群体危害期长，全年发生世代多。同时还是是 病毒的携带者和中间传媒，可以导致作物感染病毒病，严重影响农业生产。
[0003] 实践中，多使用化学药剂防治刺吸式口器害虫，比如吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪等，有 的易于产生抗性，有的农药残留时间长。农业生产中急需一种环境友好的防治刺吸式口器 害虫的生物类药剂。
【发明内容】
[0004] 为了解决以上问题，本发明提供了一种制备简单、效率高，疗效好，可对不同种蚜 虫具有良好的防治效果的茵达霉素及其制备方法及其用途。
[0005] 上述的茵达霉素，为链霉菌P56发酵产生的次生代谢产物，所述茵达霉素的菌种 保藏号为 CGMCC No. 9268。
[0006] -种茵达霉素的制备方法，其包括以下步骤：
[0007] (1)制备无菌空气，即将空气通过无菌过滤器压缩机后，滤出杂质和灰尘，得到洁 净空气；再将从压缩机压出来温度为25°C~30°C，压力为0. 25±0. 02Mpa的热空气进行二 次过滤，通过过滤部件，最后到达发酵罐；
[0008] (2)处理设备表面，即对发酵罐进行消毒处理，用质量分数为1 %的氯胺溶液处理 发酵罐5~6h，再处理结束的氯胺倒入化学专用水渠内，用水冲洗发酵罐，在接种之前再 用氯胺擦拭发酵罐的表面；
[0009] (3)制备三角瓶中种子材料
[0010] (3. 1)制备瓶装培养基，即选用适量的葡萄糖、大豆粉、氯化钠、硫酸铵、碳酸钙和 自然PH的水制备培养基；
[0011] (3. 2)灭菌三角瓶培养基，即将上述步骤（3. 1)制备的培养基放入三角瓶内，在温 度为120°C~130°C下灭菌40min，pH值为7. 1~7. 2 ;
[0012] (3. 3)菌种培养，即在无菌条件下把长有孢子的菌种接种到上述步骤（3. 2)含有 培养基的三角瓶中，再在转速为180~220rpm/min下培养36~48h，以得到优质种子液；
[0013] (4. 0)菌种培养
[0014] (4. 1)准备并检查种子罐，即选用大体积的种子罐，配置鼓泡搅拌器，提供消泡剂 材料的驱动压缩机，通过进料口放入培养基，冷却发酵罐夹套体；接着，将种子罐内设置清 洁水过滤器和空气过滤器，放空种子罐利用I %的氯胺溶液处理5h~6h ;再用稀释三倍的 氯胺彻底清洗种子罐；然后将发酵罐加压达到〇. IMpa观察发酵罐是否泄漏，同时用肥皂水 检查所有阀门；
[0015] (4. 2)灭菌种子罐和过滤器，即将上述步骤（4. 1)检查后的种子罐以及过滤器在 温度为126°C~128°C下，高压灭菌40min~60min ;
[0016] (4. 3)制备培养基并灭菌，即在上述步骤（4. 2)灭菌后的种子罐中加入温度为 40°C~50°C的水，然后在搅拌器工作下加入大豆粉和葡萄糖，并在80°C条件搅拌lOmin，然 后加入氯化钠、硫酸铵和碳酸钙，持续搅拌30min制备培养基；
[0017] (4. 4)茵达种子液转接，即将上述步骤（4. 3)三角瓶内发酵的培养物转接到种子 培养基内，按体积比5 %~10 %的接种量接种，再通过空消的装配机加入接种物质；
[0018] (4.5)转入接种物质，即将上述步骤（4.4)中培养液在转接过程中温度为 28±1°C，设备压力为0· 02Mpa~0· 05Mpa，搅拌器转速在Oh~24h为200rmp/min、24h~ 48h为250rmp/min、48h~96h为300rmp/min，空气输入量为7m 3/min，加入消泡剂，制备发 酵用种子物质；
[0019] (5)茵达发酵
[0020] (5. 1)准备及检测发酵罐，即降低压力后放空发酵罐，用水彻底清洗，检测鼓泡口 是否干净，通过水层进入Imin~2min的空气，接着检测空气通路阀门的气密性，检测进气 口和过滤器是否漏气，检查结束后，对发酵罐和过滤器进行灭菌；
[0021] (5. 2)发酵罐与过滤器的空消，即将密封的发酵罐和过滤器在126°C~130°C条件 下空消lh，发酵罐空消后降低压力，准备放入培养基；
[0022] (5. 3)配制灭菌培养基，即将由葡萄糖、大豆粉、氯化钠、硫酸铵、碳酸钙和水配制 好的培养基加入装有增加溶氧的发酵罐中，通入蒸汽〇. IMPa下灭菌30min ;
[0023] (5. 4)发酵罐内茵达合成，即按5%~10%接种量，将种子罐的发酵液转接到发酵 罐中，在发酵温度为27°C~29°C，压力为0· 015Mpa~0· 02Mpa，输入空气量为0· lL/min~ 0. 3L/min，空气温度为25°C~30°C，发酵96h，以合成茵达霉素；
[0024] (6)从原始发酵液中分离菌丝体，即取出上述步骤（5. 4)发酵罐中发酵液，利用离 心机离心，在室温下且转速为5000rpm离心10min~15min，将提取含有杂质的菌丝体移至 烧杯内，其余液体倒入另一烧杯内；
[0025] (7)从菌丝体中分离茵达，即将上述步骤（6)中的菌丝体放入甲醇或乙醇，在 500rpm下搅拌15min提取茵达，提取结束后得到稳定的乳化液；
[0026] (8)从菌丝体中分离提取物，即利用离心机在转速为5000rpm，温度为20°C，时间 为20min分离菌丝体的有机相即甲醇、乙醇和茵达，将回收的有机相加入旋转蒸发仪的烧 瓶内，分离得到的菌丝体放入另一装置内；
[0027] (9)提取物浓缩，即在温度为50°C，绝对对压力为0· 05Mpa~0· 07Mpa条件下，利 用旋转蒸发仪对提取物进行浓缩处理，蒸发开始前加入体积5%的蒸馏水，直到有机物完全 蒸发为止，离心后将水溶性的提取物放进烘干装置内，蒸发后的甲醇可以循环利用；
[0028] (10)烘干样品，即利用烘干箱，在温度为80°C，负压0. 05Mpa~0. 07Mpa条件下将 上述步骤（9)收集样品中的水分烘干，烘干后得到膏状有特殊气味物质，在膏状物中添加 2%~5%的壬基酚聚氧乙烯醚和30%~40%的抗生素制剂。
[0029] 所述茵达霉素的制备方法，其中：将所述步骤（5. 4)制备的发酵液，添加助剂后直 接喷雾干燥，得到含有抗生素和活孢子的原粉，再添加适当的润湿剂和分散剂制成可湿性 粉剂，可直接应用于农业生产，原粉中活孢子的数量可以达到LOXlO 8~1.0X1011。
[0030] 所述茵达霉素的制备方法，其中，所述步骤（3. 1)、步骤（4.3)和步骤（5.3)中的 培养基中均是葡萄糖〇. 8 %~1. 2 %、大豆粉0. 8 %~1. 2 %、氯化钠0. 4 %~0. 6 %、硫酸铵 0· 4%~0· 6%、碳酸钙 0· 2%~0· 4%。
[0031] 所述茵达霉素的制备方法，其中，所述步骤（3. 3)三角瓶内发酵的培养物是通过 三角瓶镜检检测和生物指标检测得出优质种子液；所述优质种子液指标为：培养物生长 形态状况、原生质体分布均匀、显微镜下观察菌丝体网状、排列紧密、填充整个视野、PH值 7. 0~7. 2之间、菌丝体有浅绿色-棕色、无杂菌，不符合以上一种或几种指标的种子液倒入 废水处理装置中；所述优质种子液接种时，按5%~10%接种量进行，种子液在4°C~5°C条 件下最多存放10天。
[0032] 所述茵达霉素的制备方法，其中：所述步骤（5. 1)在检测进气口和过滤器是否漏 气时，设备的压力为〇. 〇5Mpa~0. 08Mpa，通气30min，此时使链接处的阀门电气化，设备内 的压力不能超过〇.〇〇5Mpa;所述步骤（5.1)中的发酵罐是带有圆形盖的圆柱型容器，并安 装有通风搅拌装置，以提高溶氧，另外还装有消泡器、取样口、视镜、冷却水夹套、温度计和 压力表；所述步骤（5. 3)的发酵罐在其内部空气压力降低到0. 04Mpa~0. 06Mpa时，打开 出气口阀门，空气排出，以压力为标准检查所有密封口，同时把整个发酵罐用肥皂水洗涤， 检查结束以后对密封装置预热；空气进去到整个发酵罐内，通过所述消泡器、温度计和取样 口，此时设备内压力降到0. 15Mpa~0. 18Mpa，而提供热空气的温度到达126°C~130°C灭 菌Ih~I. 5h ;灭菌结束后，缓慢降低压力到0. 02Mpa，空气进入所述消泡器内，温度降至 27°C~30°C，设备内压强维持在0. 02Mpa~0. 025Mpa，此过程不能突然降低压力，以避免倒 吸入外面空气；在发酵温度为30°C~31°C时取样测pH值，镜检观察菌体生长情况，测定生 理指标。
[0033] 所述茵达霉素的制备方法，其中：所述步骤（5.4)在整个发酵过程中开口组件、 取样器、空气进样口处于高温蒸汽保护下完成，发酵结束由消耗营养物质所占比例OPB = 〇 : 1、氨氮质量分数1%和菌丝体生长形态学状态作为评判标准。
[0034] 所述茵达霉素的制备方法，其中：所述步骤（6)的离心管在离心过程中，其内部上 层为原始相，下层为菌丝体；所述步骤（7)中最终菌丝体与甲醇的重量比为1 : 5。
[0035] -种茵达霉素的用途，其中对吸式口器害虫有明显的防治作用。
[0036] 所述茵达霉素的用途，其中可用于防治豌豆蚜、棉蚜和桃蚜，还可用于防治蓟马、 飞虱和叶螨。
[0037] 有益效果：