一种全细胞催化合成香草醛的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及香料领域，尤其涉及一种全细胞催化合成香草醛的方法。
【背景技术】
[0002] 香草醛（4-羟基3-甲氧基-苯甲醛)，俗称香兰素、香草素、香兰醛、香茅醛，是全 球最重要的香味物质之一，具有浓郁的香子兰花的气味，素有"香料皇后"的美誉。其以游 离态和葡萄糖苷的形式广泛存在于自然植物中，如香荚兰豆、丁香油、天门冬、甜菜根、安息 香、苏合香膏，较集中存在于香荚兰的豆荚中(含量1. 5%_3%)。由于其特殊的香味及结构特 征，被广泛应用于各个领域，其中约60%用作食品、糖果、饮料中的香味物质，约33%用作香 料和化妆品中的成分，约7%作为药物中间体。
[0003] 香草醛每年的需求量在10, 000 t以上。目前市场上的香草醛绝大部分来自化学 合成，主要以愈创木酚和木质素为合成原料，价格较低，每公斤约13美元。由香荚兰中提取 的天然香草醛年产量仅20 t，约占0. 2%的份额，价格昂贵，每公斤达4, 000美元。而用微生 物转化法生产的香草醛与植物提取的天然香草醛等同，被称为生物香草醛，符合EU和FDA 对天然香精的食用安全要求，但目前其年产量只有数吨，每公斤价格600~1000美元。
[0004] 随着人们对健康安全的愈发重视，天然香草醛的需求不断上升。微生物转化法生 产香草醛在生产周期上和规模扩大方面要优于植物提取法，生产成本低于植物提取法，而 产品品质优于化学合成的香草醛，且无污染、对环境友好，是一种极有前景的制备方法，因 此越来越受到青睐。
[0005] 但是现有技术中，微生物转化法制备香草醛仍然存在许多不足： 1. 容易生成副产物，产率低。因为微生物本身是一个多酶体系，把它直接加入到反应 中，微生物里的某些酶可能与目的酶竞争相同的底物，导致底物利用率下降、副产物的生 成、产率低。再者，香草醛生成后也会被微生物中的酶进一步代谢为香草酸或其他代谢产 物； 2. 底物在水溶液中的溶解度很低，并且底物会对微生物的生长或酶的活性有抑制作 用； 3. 产物香草醛及其他副产物也会对微生物的生长或酶的活性有抑制作用。
[0006] 因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0007] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种全细胞催化合成香草醛的 方法，旨在解决现有技术中香草醛微生物转化合成产量低、容易生成副产物等问题。
[0008] 本发明的技术方案如下： 一种全细胞催化合成香草醛的方法，其中，包括步骤： S1、将保存的菌株CGMCC1347接入种子培养基中活化，32~40°C、100~300rpm振荡反应 6~36h得到种子液； 52、 反应结束后，取2ml种子液接入30~70ml发酵培养基中，32~40°C、100~300rpm振荡 反应12~36h得到菌液； 53、 取IOml菌液3000~6000rpm离心5~20min，弃上清，获得湿菌体； 54、 往湿菌体中加入5~15ml缓冲溶液，重悬菌体并转移至装有0. 1~0. 5g异丁香酷的锥 形瓶中，盖上橡胶塞，25~35°C、100~300rpm振荡反应48~96h ; 55、 反应结束后，加入5~15ml95%乙醇以终止反应，沉淀蛋白并溶解底物和产物，充分 混勾后 5000~8000rpm 离心 IOmin ; 56、 取离心后的上清液，用乙醇稀释，过滤后得到香草醛。
[0009] 所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述步骤S4中，锥形瓶中还添加有 50~15〇μ1离子溶剂。
[0010] 所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述离子溶剂为离子液体或深度低 共熔溶剂。
[0011] 所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述离子液体为咪唑型离子液体、铵 盐离子液体或磷盐离子液体。
[0012] 所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述咪唑型离子液体为[丽Im] [MeSO 4]、[EMIm] [MeSO4]、[BMIm] [MeSO4]、[Me (OEt) 3MIm] [Tf2N];所述铵盐离子液体为 [Choline] [Cl]、[Choline] [H2PO4]、[NMe3] [MeSO3]、[NBu4] [MeSO3]、[NMe3] [H2PO4]、[ETM] [Tf2N];所述磷盐离子液体为[PBu 4] [Ac]。
[0013] 所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述深度低共熔溶剂为胆碱醋酸盐 型DESs或胆碱氯盐型DESs。
[0014] 所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述胆碱醋酸盐型DESs为ChAc/U、 ChAc/A、ChAc/G 或 ChAc/EG〇
[0015] 所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述胆碱氯盐型DESs为ChCl/U、 ChCl/A、ChCl/G 或 ChCl/EG〇
[0016] 所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述步骤S4中，锥形瓶中还添加有 无机氮源。
[0017] 所述的全细胞催化合成香草醛的方法，其中，所述无机氮源为尿素。
[0018] 有益效果：本发明的反应体系中，通过添加离子溶剂或无机氮源，使得香草醛的产 率得到大幅提升，同时通过选用高特异性的菌株CGMCC1347,其高特异性地转化异丁香酚生 成香草醛，减少了副产物的生成，降低了后期分离纯化的成本。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明中添加不同咪唑型离子液体对香草醛产率的影响对比图。
[0020] 图2为本发明中添加不同铵盐离子液体对香草醛产率的影响对比图。
[0021] 图3为本发明中添加磷盐离子液体对香草醛产率的影响对比图。
[0022] 图4为本发明中添加不同胆碱醋酸盐型深度低共熔溶剂对香草醛产率的影响对 比图。
[0023] 图5为本发明中添加不同胆碱氯盐型深度低共熔溶剂对香草醛产率的影响对比 图。
[0024] 图6为本发明中添加不同含量尿素对香草醛产率的影响对比图。
[0025] 图7为本发明中实施例4上清液的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0026] 本发明提供一种全细胞催化合成香草醛的方法，为使本发明的目的、技术方案及 效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例 仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0027] 本发明选取了一株高特异性的菌株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中 心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，保藏编号是： CGMCC1347,此菌株已于2005年4月8日保存于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生 物保藏中心，此菌株属于纺锤芽孢杆菌Bacillus fusiformis，该菌株能够高特异性地转化 异丁香酚生成香草醛，无副产物生成。
[0028] 本发明所提供的全细胞催化合成香草醛的方法，其包括步骤： 51、 将保存的菌株CGMCC1347接入种子培养基中活化，32~40°C、100~300rpm振荡反应 6~36h得到种子液； 52、 反应结束后，取2ml种子液接入30~70ml发酵培养基中，32~40°C、100~300rpm振荡 反应12~36h得到菌液； 53、 取IOml菌液3000~6000rpm离心5~20min，弃上清，获得湿菌体； 54、 往湿菌体中加入5~15ml缓冲溶液，重悬菌体并转移至装有0. 1~0. 5g异丁香酷的锥 形瓶中，盖上橡胶塞，25~35°C、100~300rpm振荡反应48~96h ; 55、 反应结束后，加入5~15ml95%乙醇以终止反应，沉淀蛋白并溶解底物和产物，充分 混勾后 5000~8000rpm 离心 IOmin ; 56、 取离心后的上清液，用乙醇稀释，过滤后得到香草醛。
[0029] 所述步骤S4中，锥形瓶中还添加有50~15〇μ1离子溶剂，本发明中所采用的离子溶 剂分为离子液体（ILs)和深度低共熔溶剂（DESs)两大类。
[0030] 其中的离子液体（ILs)是由特定的有机阳离子和无机或有机阴离子构成的在室 温或近室温下呈液态的熔盐体系，具有蒸汽压低、熔点低、不易挥发、溶解性能优良、可设计 性高等优点，在生物催化领域具有很高的应用价值。
[0031] 其中的深度低共熔溶剂（DESs)是由季铵盐和氢键供体按照一定的摩尔比混合而 成的低熔点混合物，是一种新型的离子溶剂，与传统的离子液体性质相近，而且具有原料成 本更低、制备更简单、生物相容性更高、溶剂设计选择范围更广等优点。酶在含有DES的体 系中催化转酯化、脱氨基等反应时，其催化活性和稳定性要比在传统的有机溶剂中高。
[0032] 具体来说，本发明所涉及的离子液体（ILs)有3型共35种（咪唑型离子液体17 种、铵盐离子液体17种、磷盐离子液体1种），深度低共熔溶剂（DESs)有2型共24种（胆 碱醋酸盐深度低共熔溶剂12种、胆碱氯盐深度低共熔溶剂12种）。通过添加一定量不同的 离子溶剂，筛选出多种离子溶剂，它们的少量添加即可提高香草醛的产率。本发明还可通过 添加结构简单的无机氮源，例如尿素，来提高香草醛的产率。
[0033] 实施例1 a、将保存的菌株CGMCC1347接入种子培养基中活化，37°C、220rpm振荡反应12h得到种 子液，种子培养基（IL)的配方是：蛋白胨l〇g、酵母膏5g、NaCl 10g，调整pH至7.0; b、 反应结束后，取2ml种子液接入50ml发酵培养基中，37°C、220rpm振荡反应16h得到 菌液，发酵培养基（IL):蛋白胨 5g、KH2P04 5.2g、K2HP04.3H20 14g、MgS04.7H20 Ig (ρΗ7·0); c、 取IOml菌液5000rpm离心10min，弃上清，获得湿菌体； d、 往湿菌体中加入IOml缓冲溶液，重悬菌体并转移至装有0. 246g异丁香酷和IOOul 离子液体的锥形瓶中，盖上橡胶塞，30°C、200rpm振荡反应72h ;其中的缓冲溶液为磷酸缓 冲溶液（IL) AH2PO4 5. 2g、K2HPO4 · 3H20 14g ;pH7. 0 (下同）； e、 反应结束后，加入IOml 95% (质量分数，下同）乙醇以终止反应，沉淀蛋白并溶解底 物和产物，充分混匀后7000rpm离心10min ; f、 取离心后的上清液，用95%乙醇稀释10倍，过滤后进行HPLC检测。
[0034] HPLC检测采用甲醇和0. 01%乙酸水溶液混合梯度洗脱（0-5min，20%-60% ; 5-15min，60% ; 15-20min，60%-20%)，流速 lml/min，进样量 IOul，波长 270nm。
[0035] 如图1所示，CONTROL