一种高效生产l-瓜氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高效生产L-瓜氨酸的方法，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] L-瓜氨酸是生物体内普遍存在的氨基酸之一，是一种非蛋白氨基酸L-瓜氨酸可 以通过抗羟基对DNA和酶进行保护，可以使DNA免受氧化反应的侵害。瓜氨酸的积聚可以 增强细胞的抗氧化作用，保护细胞不受到氧化作用的侵害。L-瓜氨酸在医药方面的应用主 要是作为异体排斥效应的指示剂。在疾病治疗中，瓜氨酸的血管舒张作用也起到了很重要 的作用。在机体中瓜氨酸可以由精氨酸转化而成，这个反应释放内生NO,这种内生NO可保 持血压正常。在风湿关节炎（RA)诊断治疗中，瓜氨酸的作用也开始受到人们的关注。还有 研宄发现西瓜中瓜氨酸与"伟哥"（化学名称为枸椽酸西地非那）具有相类似的药理作用。
[0003] L-瓜氨酸作为一种重要的高值精细化学品，广泛应用于食品、医药、化工和化妆品 等工业领域中。伴随着对L-瓜氨酸研宄的不断深入，使得L-瓜氨酸在很多方面有着广泛 的应用前景，国内外需求巨大，拥有广阔的市场前景。
[0004] 目前，瓜氨酸常用生产方法主要有化学合成法、提取法、发酵法、酶转化法等。化学 合成法生产瓜氨酸是在碱性条件下水解精氨酸得到瓜氨酸。生产过程难以准确控制，产物 中含有D-瓜氨酸，影响质量，并且污染环境。由于天然产物中瓜氨酸含量较少，因此提取法 受原料来源限制，生产规模小，工艺较复杂，分离提纯困难，产酸率低，成本高，经济效益差， 因而一直没有很好的发展。发酵法生产L-瓜氨酸，主要以传统诱变选育为主，但是传统的 诱变法来获得L-瓜氨酸生产菌株随机性较大，不易得到高产菌种，尤其是瓜氨酸高产菌株 筛选条件难以确定，同时发酵过程不易控制。而酶转化法生产L-瓜氨酸有很多的优点，比 如：工艺简单、成本低、产物纯度非常高，最后的纯化步骤也较其它制备方法少。
[0005] 已有报道米用 Baker' s yeast、Streptococcus faecalis、Micrococcus pyogenes、Clostridium perfringens、Bacillus pyocyaneus 等微生物生产的精氨酸脱亚 胺基酶（Arginine Deiminase，EC3. 5· 3· 6,简称ADI)，转化L-精氨酸生产L-瓜氨酸。Ichiro Chibata等在 1973 年发现Leuconnostoc citrovorum ATCC 808KPseudomonas fluorescen IFO 3081、Pseudomonas ovalis IAM 1002 和 Psudomonas putida ATCC 4359 等菌株可以 产生ADI，以精氨酸为底物，L-瓜氨酸的终浓度可以达到80g/L。
[0006] 但是，目前经酶转化法生产L-瓜氨酸，存在转化率不够高、产量不高、转化时间长 以及生产强度小的问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种高效生产L-瓜氨酸的方 法。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种高产精氨酸脱亚胺酶工程菌及其构建方法，并利用该工程菌转 化L-精氨酸生产L-瓜氨酸。本发明提供一种高生产强度，经济，环保，低能耗的手段来生产 L-瓜氨酸的方法，该方法具有极高的生产强度，减少了工业生产的生产周期、极大提高了工 业化生产的生产效率。
[0008] 本发明的第一个目的是提供一种高效生产L-瓜氨酸的方法，是将来源于乳酸菌 的编码精氨酸脱亚胺酶的基因在大肠杆菌中诱导表达，然后以菌体或破碎后的菌体为催化 剂，转化L-精氨酸生产L-瓜氨酸。
[0009] 所述转化的条件，在本发明的一种实施方式中，是：菌体或破碎后的菌体6_25g/ U底物精氨酸浓度为150-200g/L，转化温度为30-50°C，转化时间4-12h。
[0010] 所述转化，在本发明的一种实施方式中，温度为45_50°C，转化时间为4_8h。
[0011] 所述转化，在本发明的一种实施方式中，pH为6. 5-7. 5。
[0012] 所述转化，在本发明的一种实施方式中，优选pH7. 2、50°C、菌体15-25g/L。
[0013] 所述转化，在本发明的一种实施方式中，是在摇床中进行，摇床转速为 150-250rpm〇
[0014] 所述精氨酸脱亚胺酶，在本发明的一种实施方式中，其氨基酸序列是SEQ ID NO. 1 所示的序列。
[0015] 所述精氨酸脱亚胺酶，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列是SEQ ID NO. 2 所示的序列。
[0016] 所述基因在大肠杆菌中诱导表达，在本发明的一种实施方式中，是将编码SEQ ID NO. 1序列的基因克隆到pET28a，然后将重组质粒转化到E. coliBL21 (DE3)中进行表达。
[0017] 所述转化条件，在本发明的一种实施方式中，还包括添加终浓度为2% (v/v)的异 丙醇。
[0018] 所述诱导表达，在本发明的一种实施方式中，是菌株培养至0D_为0. 4-0. 6,加入 IPTG进行诱导，2-8h后收集菌体。
[0019] 所述诱导表达，在本发明的一种实施方式中，是菌株培养至0D_为0. 6,加入终浓 度为0. 4mmol/L的IPTG进行诱导，6h后收集菌体。
[0020] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：（1)将编码SEQ ID NO. 1序列的 基因克隆到pET28a，然后将重组质粒转化到E. coli BL21 (DE3)中得到基因工程菌；（2)诱 导基因工程菌表达精氨酸脱亚胺酶，然后收集菌体；(3)将菌体洗涤后，加入菌体或破碎后 的菌体7-25g/L、精氨酸浓度为150-200g/L，在30-50°C下转化时间4-12h。
[0021] 本发明的第二个目的是一种高效表达精氨酸脱亚胺酶的方法，是：以pET28a为载 体，E. coli BL21(DE3)为宿主，表达氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述的精氨酸脱亚胺酶。
[0022] 本发明还要求保护按上述方法得到的L-瓜氨酸，以及其在食品、化工、化妆品，以 及制备药物方面的应用。
[0023] 在本发明中，菌体添加量按湿重计，是指菌悬液在8000rpm离心10min后去除上清 得到的菌体的重量。
[0024] 本发明的优点：
[0025] 1、本发明是使用来源于食品级微生物乳酸菌的精氨酸脱亚胺酶转化L-精氨酸生 产L-瓜氨酸，该酶在大肠杆菌内表达后，仍表现出很高的活力，可以满足工业化规模生产 的需求。
[0026] 2、发酵得到的菌体无需破碎，即可直接用于转化，转化使用的温度范围较宽，可以 在酶的最适温度50°C进行，高温下工程菌具有较高的透性，更有利于底物的吸收和产物的 释放，反应速度得到极大的提高。在30-50°C，产量可达110-180g/L，整个转化过程的平均 生产强度可达15. 0-37. 5g/L/h，仅需4-12h的转化周期即可达到转化终点。
【附图说明】
[0027] 图1 :底物浓度（A)和菌体浓度（B)对L-瓜氨酸产量的影响；
[0028] 图2 :透性剂对瓜氨酸产量的影响；
[0029] 图3 :水解生产L-瓜氨酸的过程曲线。
【具体实施方式】
[0030] ADI酶活力的测定：采用改进的阿氏法。酶活定义：在50°C和PH7. 2的条件下， Imin时间内产生Imol瓜氨酸的酶量为一个酶活单位。
[0031] L-瓜氨酸产量检测
[0032] 取转化液1000 Orpm离心2min，收集上清液，并以L-瓜氨酸作为标准品，配制标准 溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别与2, 4-二硝基氟苯衍生，经0. 22 μ m微孔滤 膜过滤后，，用高效液相色谱法测定L-瓜氨酸的含量。标准曲线在200-800mg/L之间呈现 良好的线性关系，回归方程：y = 〇. 5319x-103. 5203, R2= 0. 9990。
[0033] 高效液相色谱法测定L-瓜氨酸的含量
[0034] 色谱柱：C180DSHYPERSIL ;
[0035] 流动相：磷酸盐缓冲液（pH7. 0)-乙腈-水（体积比为70:20:10)，用0. 22 μ m滤 膜过滤；
[0036] 柱温：35°C ;
[0037] 检测波长：360nm ;
[0038] 进样量：10μ1;
[0039] 流速：lml/min。
[0040] 实施例1 :含精氨酸脱亚胺酶基因工程菌的构建
[0041] 按以下方法构建含精氨酸脱亚胺酶基因工程菌：
[0042] (1)通过分子生物学手段用序列分别如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示的引物1 :
[0043] 5, -CATGCCATGGCAATGAACAATGGAATTAATGTTAACTCAG-3,和引物 2:
[0044] 5'-CCGCTCGAGTTACAAATCTTCACGGCAAAGTGG-3' 将来自于 Lactococcus Iactis 的 精氨酸脱亚胺酶基因（氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示） 进行PCR扩增：体系中加入LAtaq酶，94°C预变性3min，94°C变性30s，55°C退火30