一种用于检测蚊虫所携带的多种病原体基因芯片以及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因芯片领域，具体涉及一种用于检测蚊虫所携带的多种病原体基因 芯片以及检测方法。
【背景技术】
[0002] 蚊媒病在预防医学中占有重要地位，因由蚊类传播而传播力强、发病率高、危害范 围大，对人类的健康以及生命安全具有较大的威胁。在我国流行或曾经流行的蚊媒病有疟 疾、淋巴丝虫病、乙型脑炎、登革热等。检测蚊媒携带病原体是极早期发现流行、预防蚊媒病 的有效措施之一。
[0003] 简便准确的检测方法是发现蚊传病原体的重要技术保障，掌握其流行规律和趋势 为评价防治效果和制订防治对策提供科学依据，还可用于蚊传疾病的临床检测。早期诊断 蚊媒病的方法多采用显微镜镜检，该方法简便、费用低廉，结果也相对准确。但由于蚊虫携 带病原体的感染率通常为千分之几，显微镜检耗费时间，不适宜大量的样品检测；同时需要 有经验和专业背景的技术人员操作，不适用于检测蚊传病原体密度极低的样品。显微镜检 对于蚊媒病毒的检测也不适用。而后发展了免疫学方法，如酶联免疫吸附试验、免疫吸附层 析等，相对于显微镜镜检的方法，免疫学方法的敏感度以及通量均有所提高，大大提高了检 测效率；随后发展了更敏感的聚合酶链式反应（PCR)方法，PCR的优点是灵敏度高，但是通 过凝胶电泳对PCR结果进行检测有可能因为非特异扩增导致假阳性判断，或者有可能引物 扩增条带信号很微弱在凝胶电泳上不可见，造成假阴性判断，而对PCR产物进行测序则比 较繁琐并且费时。
[0004] 蚊虫往往同时携带多种病原体，上述方法只能进行单一病原体的检测，且通量不 高。虽然有多重PCR技术，但随着引物对的增加，影响反应结果。因此，采用上述方法无法 同时进行大批量复合致病原的检测。
[0005] 生物芯片技术是近年来在生命科学领域中迅速发展并成熟的一项高新技术，主要 是通过微加工技术和微电子技术在固相芯片表面构建的微型生物化学分析系统，可实现对 细胞、蛋白质、核酸以及其他多种生物成分的准确、快速、大量信息的检测。生物芯片的主 要特点是高通量、微型化和自动化，主要包括三类：基因芯片、蛋白质芯片以及芯片实验室。 现有技术中，已有采用基因芯片进行某一属的多种病毒的检测，如专利号为CN 101781687A 的专利中，公开了一种检测黄病毒属多种病毒的基因芯片，但对于可同时检测分类地位相 差较远的多个属（病毒、原虫、蠕虫等）病原体的基因芯片，尚未有人进行过。
【发明内容】
[0006] 本发明是为解决上述问题而进行的，通过提供一种可同时检测蚊虫所携带的多种 病原体的基因芯片，提高检测的效率和准确性。
[0007] 本发明采用了如下技术方案：
[0008] 本发明提供的一种用于检测蚊虫所携带的可感染人体的多种病原体的基因芯片， 具有这样的特征，包括：基片；以及固定于基片上的探针，其中，探针包括黄病毒属探针、丝 虫属（淋巴丝虫）探针以及疟原虫属探针，黄病毒属探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1~7所示，丝虫属探针的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No. 8~10所示，疟原虫属 探针的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No. 11~17所示。
[0009] 本发明提供的用于检测蚊虫所携带的多种病原体的基因芯片，还可以具有这样的 特征：黄病毒属包括登革热病毒1~4型、日本脑炎病毒以及西尼罗病毒；丝虫属包括两种 淋巴丝虫：马来丝虫以及班氏丝虫；疟原虫属包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、 诺氏疟原虫以及卵形疟原虫。
[0010] 本发明提供的用于检测蚊虫所携带的多种病原体的基因芯片，还可以具有这样的 特征：基片采用醛基进行修饰，和基片连接的探针的5 '端采用氨基进行修饰。
[0011] 本发明提供的用于检测蚊虫所携带的多种病原体的基因芯片，还可以具有这样的 特征：在探针5 '端修饰的氨基基团与探针的杂交部位之间设置间隔臂，用于减少病原体 核苷酸序列和探针之间的杂交空间位阻，间隔臂的结构为16聚脱氧胸苷酸。
[0012] 进一步的，本发明还提供了一种用于检测蚊虫所携带的多种病原体的基因芯片检 测蚊虫所携带的多种病原体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0013] 步骤一，将感染病原体的样品进行核酸提取处理，得到待测样品，并对待测样品进 行PCR反应处理，得到待测样品的扩增产物；
[0014] 步骤二，将扩增产物进行标记；
[0015] 步骤三，将步骤二中的扩增产物在预定温度下和基因芯片进行杂交，得到杂交产 物；
[0016] 步骤四，将步骤三中的杂交产物进行扫描处理，得到检测结果。
[0017] 本发明提供的基因芯片检测蚊虫所携带的多种病原体的方法，其特征在于：待测 样品进行PCR反应处理时，黄病毒属病毒的上游引物序列如SEQ ID NO. 18所示，下游引物 序列如SEQ ID NO. 19所示；丝虫属的上游引物序列如SEQ ID NO. 20所示，下游引物序列如 SEQ ID NO. 21所示；疱原虫属的上游引物序列如SEQ ID NO. 22所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 23 所示。
[0018] 本发明提供的基因芯片检测蚊虫所携带的多种病原体的方法，其特征在于：PCR 反应的条件为：50°C预变性5min，94°C变性5min ;94°C变性25s ;54°C退火25s ;72°C延伸 30s，反应35个循环；72°C延伸5min。
[0019] 本发明提供的基因芯片检测蚊虫所携带的多种病原体的方法，其特征在于：扩增 产物采用Biotin进行标记。
[0020] 本发明提供的基因芯片检测蚊虫所携带的多种病原体的方法，其特征在于：杂交 的温度为41 °C。
[0021] 进一步的，本发明还提供了一种用于检测蚊虫所携带的多种病原体的基因芯片制 备的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括基因芯片、PCR反应试剂以及显色反应试剂。
[0022] 发明作用与效果
[0023] 本发明提供了一种可同时检测蚊虫所携带的可感染人体的多种病原体的基因芯 片及其检测方法，包括基片以及固定于基片上的黄病毒属探针、丝虫属探针以及疟原虫属 探针，使得该基因芯片可同时检测蚊虫携带的多种分类地位相差较远的病原体，同时本发 明中的检测方法操作步骤简单、特