用于生产发酵产物的方法
【专利说明】用于生产发酵产物的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法。本发明还涉及一种适于在本 发明的方法中使用的组合物。
[0002] 对序列表的引用
[0003] 本申请包含一个计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在 此。
[0004] 发明背景
[0005] 从含淀粉材料生产发酵产物，例如，乙醇，是本领域中熟知的。目前在工业上使用 两种不同种类的方法。最常使用的方法通常被称作"传统方法"，并且包括在高温下典型地 使用一种细菌α -淀粉酶液化糊化淀粉，随后在葡糖淀粉酶和发酵生物的存在下进行同时 糖化发酵。另一种众所周知的方法通常被称作"生淀粉水解方法（RSH法），包括典型地 在至少一种葡糖淀粉酶的存在下在低于初始糊化温度进行颗粒淀粉的同时糖化和发酵。
[0006] 尽管在过去几十年中发酵产物生产发生了显著改善，但是显著量的残余淀粉材料 未被转化为所希望的发酵产物，例如乙醇。这些未转化的残余淀粉材料中的至少一部分，例 如，糖和糊精，处于未发酵的美拉德（Maillard)产物的形式。
[0007] 因此，仍然存在对于提供用于从含淀粉材料生产发酵产物，例如，乙醇的方法的希 望和需求，这些方法可以提供更高的发酵产物得率，或与传统方法相比的其他优点。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明涉及使用一种发酵生物，从含淀粉材料生产发酵产物，例如，乙醇的方法。 [0010] 在第一方面，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物，例如，乙醇的方法，该 方法包括以下步骤
[0011] i)在高于初始糊化温度的温度下，使用以下项液化该含淀粉材料：
[0012] -一种α-淀粉酶；
[0013] -任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80°C /70°C下的相对活性的、超过 20%的热稳定性值；并且
[0014] -任选地一种产碳水化合物源的酶；
[0015] ii)使用一种产碳水化合物源的酶进行糖化；
[0016] iii)使用一种发酵生物进行发酵；
[0017] 其中在发酵过程中或同时糖化发酵过程中存在或添加一种纤维素分解组合物。
[0018] 下文描述了适合的纤维素分解组合物。在一个优选的实施例中，该纤维素分解组 合物来源于里氏木霉。
[0019] 在一个优选的实施例中，在从70-100 °C之间，例如在75-95 °C之间，例如在 75-90°C之间，优选在80-90°C之间，例如82-88°C，例如约85°C的温度下进行液化。
[0020] 在一个实施例中，液化过程中的pH是从4. 5-5. 0,例如在4. 5-4. 8之间。在另一个 实施例中，在高于5. 0-6. 5,例如在高于5. 0-6. 0,例如在高于5. 0-5. 5,例如在5. 2-6. 2之 间，例如约5. 2,例如约5. 4,例如约5. 6,例如约5. 8的pH下进行液化。
[0021] 在一个第二方面，本发明涉及一种酶组合物，包括：
[0022] --种α -淀粉酶；
[0023] -任选地一种蛋白酶，该蛋白酶具有确定为在80°C /70°C下的相对活性的、超过 20 %的热稳定性值；以及
[0024] -任选地一种支链淀粉酶；
[0025] -任选地一种产碳水化合物源的酶。
[0026] 所存在的α -淀粉酶可以是任何α -淀粉酶，优选一种细菌α -淀粉酶，特别是来 自嗜热脂肪芽孢杆菌，尤其是其热稳定性变体。下文给出了热稳定性变体的实例。优选的 实例包括α-淀粉酶，该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：
[0027] -I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E ；
[0028] -I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q25 4S ；
[0029] -I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V ;
[0030] -I181*+G182*+N193F+V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V ;以及
[0031] -I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S。
[0032] 本发明的组合物任选地包括一种支链淀粉酶。该支链淀粉酶可以是GH57家族支 链淀粉酶，例如包括如WO 2011/087836中披露的X47结构域的一种支链淀粉酶。更多的实 例在下文的"液化过程中存在的和/或添加的支链淀粉酶部分中给出。
[0033] 在本发明的实施例中，任选地存在热稳定性蛋白酶和/或产碳水化合物源的酶， 特别是葡糖淀粉酶。
[0034] 热稳定性蛋白酶的实例可以发现于下文的"液化过程中存在的和/或添加的蛋白 酶部分中。在一个优选的实施例中，该热稳定性蛋白酶是如在此的SEQ ID N0:3所示的 金黄色嗜热子囊菌蛋白酶的，或来源于激烈热球菌的一种菌株的蛋白酶的，特别是如在此 的SEQ ID NO: 13的、在此的SEQ ID N0:29所示的或披露于美国专利号6, 358, 726-B1中的 蛋白酶的一种变体。
[0035] 适合的任选的产碳水化合物源的酶的实例，优选热稳定性产碳水化合物源的酶， 特别是一种热稳定性葡糖淀粉酶，可以发现于下文的"液化过程中存在的和/或添加的产 碳水化合物源的酶"-部分中。
[0036] 在一个实施例中，该产碳水化合物源的酶，特别是一种葡糖淀粉酶，是草酸青霉菌 葡糖淀粉酶，或其变体。
[0037] 还可以存在其他酶活性。
[0038] 定义
[0039] 龜j
[0040] 纤维素分解组合物、纤维素分解酶或纤维素酶是指一种制剂，该制剂包括一种或 多种（例如，若干种）水解纤维素材料的酶。这类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或 多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或它们的组合。用于测量纤维素分解活性 的两种基本方法包括：（1)测量总纤维素分解活性，和⑵测量单独的纤维素分解活性（内 切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶以及β-葡糖苷酶），如在张（Zhang)等人，纤维素酶改进的 展望：筛选和选择策略（Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies)，2006,生物技术进展（Biotechnology Advances) 24:452-481 中所综述的。通 常使用不溶性底物，包括沃特曼（Whatman) N2 1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维 素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解活性。最常用的总纤维素分解活性测 定是使用沃特曼Ne 1滤纸作为底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会 (International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC))(高斯（Ghose)，1987， 纤维素酶活性的测量（Measurement of cellulase activities)，纯粹与应用化学（Pure Appl.Chem. )59:257-68)确立的。
[0041] 可以通过测量在以下条件下与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比，由一种 或多种纤维素分解酶对纤维素材料的水解的增加来测定纤维素分解酶活性：l-50mg的纤 维素分解酶蛋白/g于预处理的玉米秸杆（"PCS"）中的纤维素（或其他预处理的纤维素材 料），在适合的温度（例如50°C、55°C、或60°C)下持续3-7天。典型条件为：1ml反应，洗 涤或未洗涤的？〇3,5%不溶性固体，50禮乙酸钠（?!15)，111111^0 4,50°〇、55°〇、或60°〇，72 小时，通过ΑΜ?ΝΕΧ? HPX-87H柱（伯乐实验室有限公司，美国加州赫拉克勒斯）进行糖 分析。
[0042] 家族61糖苷水解酶：术语"家族61糖苷水解酶"或"家族GH61"或"GH61" 意指根据亨利萨特（Henrissat)B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分 类(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities)，生物化学杂志（Biochem.J. )280:309-316 ;和亨利萨特B.和贝洛赫 (Bairoch)A.，1996,修正糖基水解酶的基于序列的分类（Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases)，生物化学杂志 316:695-696 属于糖昔水解 酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中测量到的非常弱的内 切-1，4-β -D葡聚糖酶活性而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规 范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于它们在与纤维素酶或纤维素酶的混合 物结合使用时增强木质纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
[0043] 具有纤维素分解增强活性的多肽：术语"具有纤维素分解增强活性的多肽"意指促 进具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。出于本发明的目的， 纤维素分解增强活性通过测量来自由纤维素分解酶在以下条件下水解纤维素材料的还原 糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定：l-50mg总蛋白质/g于预处理的PCS中 的纤维素，其中总蛋白质由50-99. 5% w/w纤维素分解酶蛋白以及0. 5-50% w/w GH61多肽 (具有纤维素分解增强活性）的蛋白质构成，在合适的温度（例如，50°C、55°C或60°C)以 及pH(例如，5. 0或5. 5)下持续1-7天，与用相等的总蛋白质负载量而无纤维素分解增强活 性（l-50mg纤维素分解蛋白/g于PCS中的纤维素）的对照水解相比较。在一个方面，使用 在总蛋白质重量的2%-3%的米曲霉β-葡糖苷酶（根据WO 02/095014在米曲霉中重组 产生）或总蛋白质重量的2%-3%的烟曲霉β-葡糖苷酶（如WO 2002/095014中所描述 在米曲霉中重组产生）的纤维素酶蛋白负载量存在的情况下CELLUCLAST? 1.5L(诺 维信A/S)，丹麦巴格斯瓦尔德（Bagsvaerd，Denmark))的混合物作为纤维素分解活性的来 源。
[0044] 具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维 素分解酶的量降低优选至少1.0 l倍，例如，至少I. 05倍、至少I. 10倍、至少I. 25倍、至少 I. 5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、