一种草菇免疫调节蛋白FIP-vvo79及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于真菌免疫调节蛋白领域，特别涉及一种草菇免疫调节蛋白FIP-VV079 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 利用大型真菌（蘑菇）及其活性物质治疗人类疾病在亚洲国家有着悠久的历史， 可以追溯到公元前3000年，由于其在免疫调节和抗癌方面的出色表现，近十年来在西方国 家也逐渐受到重视。过去对于大型真菌活性物质的研宄多集中在多糖和三萜，对于蛋白质 的研宄相对较少，但随着生物技术在药物研宄和开发中的应用，特别是对中草药中基因、蛋 白和药理作用之间关系研宄的逐渐深入，真菌蛋白逐步得到了重视，其中真菌免疫调节蛋 白（Fungalimmunomodulatoryprotein，FIP)，由于其具有广泛的免疫生物活性，而备受国 内外关注。
[0003] 真菌免疫调节蛋白（Fungalimmunomodulatoryprotein，FIP)是从高等担子菌中 分离得到的一类具有免疫调节活性的小分子蛋白质，其结构与功能与植物凝集素和免疫球 蛋白重链可变区相似，具有促进淋巴细胞增殖、调控细胞周期、诱发细胞凋亡、影响细胞因 子的表达、活化细胞粘附分子和抗过敏反应等免疫调节作用，拥有良好的临床应用前景和 药用保健价值。自1989年，日本人Kino从灵芝（Ganodermalucidum)子实体中分离到第一 个真菌免疫调节蛋白，命名为LingZhi-8 (LZ-8)，并对其基因序列，氨基酸顺序和免疫生理 活性进行了测定。到目前为止，共有8种FIPs被分离纯化出来，它们来自于灵芝（Ganoderma lucidium)，松杉灵芝（G.tsugae)，紫芝（G.japoncium)，小孢子灵芝（G.microsporum)，甜 灵芝（G.sinense)拱状灵芝（G.fornicatum)，金针葫（Flammulinavelutipes)和草葫 (Volvariellavolvacea)，分别被命名为LZ-8 (FIP-glu)，FIP-gts，FIP-gja(AY987795)，FI P-gmi,FlP-sin,FIP-gfo，FIP-fve和FIP-vvo,共同组成了一个新的蛋白质家族 _FIPs。在 FIPs家族中除了金针菇免疫调节蛋白（FlP-fve)和草菇免疫调节蛋白（FIP-vvo)以外，其 他的FIPs都是从不同种灵芝中分离得到的，这说明虽然都是灵芝但由于种类的不同，而具 有不同的免疫调节蛋白，甚至同种灵芝中就存在多种免疫调节蛋白。例如叶波平等从灵芝 (G.microsporum)中分离到3个蛋白质：LZP-l、LZP-2和LZP-3。体外实验表明3种灵芝蛋 白具有较强的促进淋巴细胞增殖活性，而且SDS-PAGE表明其分子量与LZ-8不同，所以他们 获得了 3种新的灵芝免疫调节蛋白。这样的情况同样发生在草菇中。除了 1997年Hsu，H. C.等人在草菇子子实体中通过分离纯化和验证，并经过直接氨基酸测序得到由112个氨基 酸组成的分子量约为12. 67KDa的一种草菇免疫调节蛋白（FIP-vvo)以外，还有可能存在其 它种草菇免疫调节蛋白。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种草菇免疫调节蛋白FIP-vvo79及其制备 方法，通过比较基因组等生物信息学方法筛选到一种同样来源于草菇，但基因序列和氨基 酸序列都不同于FIP-vvo的具有免疫调节作用的免疫调节蛋白FIP-vvo79,其适用于在保 健品和医药中使用。
[0005] 本发明提供了一种草菇免疫调节蛋白FIP-W079,所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO. 1所示。该草菇免疫调节蛋白FIP-wo79全长113个氨基酸，理论分子量为12. 82kDa。
[0006] 本发明还提供并合成了编码上述草菇免疫调节蛋白FIP-VV079的基因。该基因 cDNA序列如SEQIDNO. 2所示。
[0007]本发明通过一对引物FIP-vvo79-F(NdeI5'-CATATGTCTACCGATITGA-3'） 和FIP-vvo79-R(EcoRI5'-CTTAAGTTAITCCACTGAGCA-3'）。用基因克隆的方法得到 了这一草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇79的基因序列，DNA全序列分析结果表明，FIP-VV〇79基 因全长338bp。
[0008] 该蛋白属于一种草菇免疫调节蛋白。将其cDNA序列在GenBank中进行BLAST比对，没有发现与其相似的基因序列，而将其氨基酸序列在NCBI的无冗余蛋白序列数 据库（nr)中进行BLAST比对发现，该蛋白与来源于平盖灵芝（G.applanatum)、赤芝 (G.lucidum)和小孢子灵芝（G.microsporum)免疫调节蛋白的相似性达到63%，与金针葫 (F.velutipes)免疫调节蛋白FIP-fve为57%。说明FIP-vvo79是一种新的真菌免疫调节 蛋白，其编码的基因是一个新的基因。并为此编码此蛋白的基因改造和在各种外源基因表 达系统中高效表达提供优良的基因资源。
[0009] 本发明还提供了包含上述草菇免疫调节蛋白FIP-VV079基因的重组载体，优先选 为pET-28b(+)。将本发明的草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇79基因插入到表达载体合适的限制 性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最 优选的方案，优选为将草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇79基因插入到pET-28b(+)上的EcoRI和 Ndel限制性酶切位点之间，得到重组大肠表达质粒pET-FIP-vv〇79。
[0010] 本发明还提供了包含了上述草菇免疫调节蛋白FIP-VV079基因的重组菌株，优选 为重组菌株BL21-FIP-vvo79。
[0011] 本发明还提供了一种制备草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇79的方法，包括以下步骤：
[0012] 1.上述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
[0013] 2.培养重组菌株，诱导重组草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇79的表达；
[0014] 3.超声破碎获取所表达的草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇79。
[0015] 其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)细胞，优选将重组表达质粒转化 大肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株BL21-FIP-VV〇79。运用基因工程手段来产业化生 产草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇79产品还未见报道。本发明首次提供了一个真菌免疫调节蛋 白FIP-VV〇79,可作应用于保健品和医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基 因工程手段生产草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇79。
[0016] 本发明利用生物信息学的方法，在草菇基因组中发现了一种与已知草菇免疫调节 蛋白（FIP-vvo)差异性达到5%即相似性为95%的新的草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇79及 其编码基因序列。并利用分子生物学和生物工程技术，构建高效表达这种草菇免疫调节蛋 白的工程菌株，超声破碎得到重组草菇免疫调节蛋白FIP-VV〇79,对其进行了免疫学功能鉴 定。本发明不仅丰富了FIPs的种类，而且为深入开展全新草菇免疫调节蛋白的开发及应用 奠定基础。
[0017] 有益效果
[0018] 根据本发明的对机体具有免疫调节作用的真菌免疫调节蛋白及其基因序列，可以 制备出提高人体免疫力的保健食品，防治由于免疫力下降所导致的疾病的危害。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明的草菇免疫调节蛋白FIP-VV079在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE分 析；其中，1为表达载体蛋白；2为分子量标准；3为重组菌株蛋白BL21-FIP-VV〇79。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0021] 1.细胞株：Jurkat细胞。
[0022] 2.试剂盒、酶类、生化试剂和仪器：
[0023] 试剂盒：ELISAKIT96THumanIL-2试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司。 96孔培养板，血球计数板。
[0024] PCR引物合成和基因测序均由上海生工生物公司完成。
[0025] 酶类：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。
[0026] 仪器：离心机；振荡摇床；显微镜；酶标仪。
[0027] 生化试剂：氨苄青霉素，卡那霉素，青霉素，链霉素，胎牛血清（FBS)。
[0028] 3.培养基：RPMI-1640培养液（含10 %的FBS，青