一种路氏肠杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体而言，涉及一株利用魔芋粉产甘露聚糖酶 能力较强的路氏肠杆菌（Enterobacterludwigii)及其应用。
【背景技术】
[0002] 半纤维素是自然界第二大类杂聚多糖，其中甘露聚糖是一种主要的半纤维 素。甘露聚糖广泛存在于槐豆胶、瓜尔豆胶、魔芋精粉和其他植物多糖中。甘露 聚糖酶（0-1^111^1^%3〇3.2.1.78)能够水解主链上含有0-1，4甘露糖苷键的多聚糖 (0_甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖）为甘露低聚糖。获得的甘露低聚糖有很好的 生物调节功能，能有效降低人体胆固醇水平、降低血糖、促进肠道中双歧杆菌的生长，是良 好的食品添加剂。该酶还广泛应用于饲料、造纸、纺织印染、石油开采和生物学研宄等诸多 方面。如在造纸工业中，甘露聚糖酶和木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用，处理纸 浆，能明显改善纸质，降低氯漂和碱提取带来的环境污染；0 _甘露聚糖酶是油井石油压裂 液的优质生物破胶剂；在饲料工业中用作饲料酶添加剂，起到消除抗营养因子的作用和改 善饲料的营养价值。
[0003] 以微生物为0 _甘露聚糖酶的酶源，具有制备方便且酶活性高的优势，由于酶获 取成本低，促进了对该酶的研宄及应用。Lin等通过黑曲霉（AspergillusnigerNCH189) 液态发酵获取甘露聚糖酶，产酶水平为27. 4U/mL。Hossain等用芽孢杆菌（Bacillus sp.KKOl)进行液态发酵，产酶水平可达90U/mL。Ferreira等以麦麸为碳源培养嗜热菌 (TrichodermaharzianumstrainT4)产胞外0-甘露聚糖酶。李剑芳、部敏辰等人通过筛 选以及紫外诱变等手段，从其实验室保存的菌株中筛选到一株优良的酸性0 _甘露聚糖酶 高产菌株（Aspergil-lususamiiYL-01-78)。杨幼惠等利用刚果红平板筛选法从芽抱杆菌 中筛选得到产甘露聚糖酶的优良菌株。罗强、孙启玲等人通过离子注入以及紫外线复 合诱变的方法，筛选到一株产0-甘露聚糖酶的枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis)。
[0004] 经过查阅国内外现有技术，暂时没有报道使用路氏肠杆菌利用魔芋粉产e-甘露 聚糖酶的文献。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种产0 _甘露聚糖酶的路氏肠杆菌（Enterobacter ludwigii)及其应用。
[0006] 为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验反复进行菌种选育研宄，并最终 从十堰竹溪魔芋种植基地的土壤中筛选到一株产甘露聚糖酶的菌株路氏肠杆菌 (Enterobacterludwigii)，通过对其进行培养条件及培养基优化，提高了该菌株的产酶水 平，为甘露聚糖酶的工业化生产和应用提供了科学依据。
[0007] 具体地，本发明获得了 一株产甘露聚糖酶能力较强的路氏肠杆菌 (Enterobacterludwigii)，将其命名为路氏肠杆菌（Enterobacterludwigii)MY271，已 于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为：CCTCCNO:M2015182。
[0008] 本发明涉及的高产|3 -甘露聚糖酶的路氏肠杆菌（Enterobacterludwigii) MY271具有如下特征和特性：
[0009] 形态学特征：菌落呈圆形，乳白色，表面光滑，边缘整齐。
[0010] 生理特性：利用葡萄糖、果糖、鼠李糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、半乳糖、 L-阿拉伯糖、肌醇、乳糖、山梨醇以及D-棉子糖等作为碳源。
[0011] 代谢特性：代谢过程能产甘露聚糖酶。
[0012] 最优的发酵培养条件为：发酵时间48h，温度31°C，接种量9%，初始PH7.0,装液 量 50mL/250mL，培养基成分：魔芋粉 14g/L、蛋白胨 18g/L、KH2P04 0? 5g/L、Na2HP04 0? 7g/L、 MgS04 0 . 01g/L、ZnS04 0? 15g/L。
[0013] 本发明涉及的高产0 _甘露聚糖酶的路氏肠杆菌（Enterobacterludwigii) MY271是按照如下方法获得的：从湖北十堰竹溪魔芋种植基地采集土样4份。每份样品中 称取5g混合土样加入到无菌生理盐水中，在30°C，160r/min的恒温摇床上充分振荡2h制 备菌悬液，然后取2mL土壤悬液加入到富集培养基（魔芋粉5.Og/L，蛋白胨5.Og/L，KH2P04 1. 0g/L，MgS04 0?lg/L，pH自然 0?IMPa灭菌 20min)，30°C，160r/min下振荡培养 48h。富 集培养所得菌液进行梯度稀释，取适当稀释后的菌液l〇〇uL涂布于初筛平板培养基（魔芋 粉 5. 0g/L，NH4C1 5. 0g/L，KH2P04 1. 0g/L，MgS04 0?lg/L，琼脂 20g/L，pH自然 0?IMPa灭菌 20min)，于30°C培养箱中倒置培养48h，每个稀释梯度做3次平行。菌株培养48h后，往平板 中加适量刚果红染液，静置l〇min，观察黄色水解圈的大小及透明度，挑选水解圈直径大且 透明度好的菌株保存于试管斜面培养基（蛋白胨l〇g/L，牛肉膏3. 0g/L，NaCl5. 0g/L，琼脂 20g/L，自然pH，0.IMPa灭菌20min)，以备摇瓶发酵试验。通过摇瓶发酵（魔芋粉5. 0g/L，蛋 白胨 5. 0g/L，KH2P04 1. 0g/L，MgS04 0?lg/L，pH自然，0?IMPa灭菌 20min)试验，其中的一株 路氏肠杆菌的发酵液酶活最高，将其命名为路氏肠杆菌（Enterobacterludwigii)MY271， 同时于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM2015182。
[0014] 与现有技术相比，本发明获得的路氏肠杆菌（Enterobacterludwigii)MY271具有 如下优点和显著进步：
[0015] (1)本发明所选育的菌株可利用魔芋粉产甘露聚糖酶，发酵后所得发酵液中 0 -甘露聚糖酶的酶活高达62. 76U/ml。
[0016] (2) 甘露聚糖酶降解甘露聚糖得到的甘露低聚糖有很好的生物调节功能，能有 效降低人体胆固醇水平、降低血糖、促进肠道中双歧杆菌的生长，是良好的食品添加剂。
【附图说明】
[0017]图1为接种量对酶活的影响柱形图；
[0018] 图2为装液量对酶活的影响柱形图；
[0019] 图3为初始pH对酶活的影响柱形图；
[0020] 图4为发酵温度对酶活的影响柱形图；
[0021] 图5为发酵周期对酶活的影响柱形图；
[0022] 图6为碳源对酶活的影响柱形图；
[0023] 图7为碳源添加量对酶活的影响柱形图；
[0024] 图8为氮源对酶活的影响柱形图；
[0025] 图9为氮源添加量对酶活的影响柱形图；
[0026] 图10为无机盐对酶活的影响柱形图；
[0027] 图11为磷酸二氢钾用量的优选试验结果柱形图；
[0028] 图12为蛋白胨用量的优选试验结果柱形图；
[0029] 图13为氯化钠用量的优选试验结果柱形图；
[0030] 图14为硫酸锌用量的优选试验结果柱形图。
【具体实施方式】
[0031] 以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理 解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。
[0032] 需要说明的是，本发明中的术语酶活定义为：每分钟水解甘露聚糖产生 1ymol还原糖所需酶量定义为一个酶活力单位（U)。
[0033] 粗酶液的制备方法为：取一定体积的菌液于离心管中，8000rpm离心15min取上清 液，稀释适当倍数后，则为粗酶液。
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