一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种简化的胎盘源胎儿干细胞的分离方法。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSC)是干细胞家族的重要成员，来源 于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分 化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。 MSC主要存在于结缔组织和器官间质中（如骨髓基质、脂肪、皮肤真皮、胎盘、骨骼肌、脐带 血和脐带等）。MSC在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、 韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜 能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
[0003] 研宄表明，MSC不表达MHC-II类分子和FasL，不表达共刺激分子B7-l、B7-2,低水 平表达或不表达MHC-I类分子、⑶40和⑶40L。此外，将MSC与异基因外周血单个核细胞 或同种异体T淋巴细胞共培养后不能引起同种异体T淋巴细胞显著增殖，说明MSC具有低 免疫原性和较低的抗原提呈能力。
[0004] 鉴于MSC的多向分化潜能和其特殊的免疫学特征，MSC有着广阔的临床应用前景。 应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切 除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，MSC在 神经系统修复及更多方面具有长远的发展前景。
[0005] 2006年，我国在胎盘和脐带组织中分离出间充质干细胞，这种组织来源的间充质 干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且还具备如下优点：①胎盘和脐带中的 干/祖细胞更原始，有更强的增殖分化能力。②免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不会触发 免疫反应及引起移植物抗宿主病。③干细胞易于分离，纯度高，无肿瘤细胞污染。④扩增时 培养体系能统一，便于质控。⑤可制成种子细胞冷冻，多次使用，冷冻后细胞损失小。⑥潜 伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低。⑦采集时对产妇及新生儿无任何危害及 损伤。⑧采集方便，易于保存和运输，伦理学争议少。这种胎盘和脐带来源的间充质干细 胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。但胎盘间充质干 细胞的分离提取过程繁琐且提取效率低，间充质干细胞的规模化制备成了其广泛应用的瓶 颈。胎盘中细胞种类丰富，获取的间充质干细胞纯度不高也限制了胎盘间充质干细胞在临 床上的应用。
[0006] 目前胎盘间充质干细胞多采用酶消化法和灌流法来制备。酶消化法是将胎盘组织 剪成碎块后，用胰蛋白酶或胶原酶消化1-2小时，用含胎牛血清的培养基终止酶消化，然后 洗涤细胞弃去消化酶，洗涤后的细胞接种至培养器皿中进行培养扩增。洗涤细胞需时约1 小时，且洗涤过程中对细胞损伤较重，操作步骤繁琐，耗时耗力；使用消化酶进行消化时需 酶量大，耗材多，易污染，消化酶对细胞损伤亦较重，最终导致获得的细胞活力低、增殖慢。
[0007] 灌流法是利用胎盘特殊的解剖结构，用灌流液孵育胎盘，从灌流液中分离单个核 细胞，洗涤后用间充质干细胞培养基悬浮所获细胞，进行培养。该方法从胎盘组织中提取间 充质干细胞，胎盘中血液含量非常多，冲洗时消耗试剂多，且易冲洗不彻底。
[0008] 胎盘中细胞种类丰富，通过简单的方法获取单一的胎盘源胎儿间充质干细胞是一 个亟待解决的问题。
【发明内容】
[0009] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种胎盘源胎儿干细胞的分离方 法，将制备过程程序化，简化操作步骤，缩短操作时间，减少工作量，从而也可在很大程度上 避免污染，减少制备过程所需试剂和耗材的使用量，同时增加了间充质干细胞的产量，所得 细胞全部为单一来源的胎盘源胎儿间充质干细胞。
[0010] 本发明的一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，是取新鲜胎盘，经过病毒检测合格 后，用缓冲液洗去污物及血液；从胎盘中分离得到绒毛膜，使用缓冲液洗去绒毛膜中的红 细胞；然后将绒毛膜剪碎，用PBS缓冲液进行重悬，然后加入红细胞裂解液去除红细胞；然 后加入L-DMEM培养基洗涤，离心弃上清液，在组织块沉淀中加入含10% -20%体积FBS的 DMEM培养基混匀，接种后进行培养。
[0011] 进一步的，所述接种后培养2411后补加含10%-20%体积？85的01^11培养基，继 续培养，每3天换一次培养基；培养至8-9天组织块周围出现梭形细胞爬出；培养至16-19 天细胞达80%左右融合时进行传代培养；以后每3天传代一次，传代至第三代进行鉴定。
[0012] 进一步的，所述缓冲液为含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素的PBS缓冲液。
[0013] 进一步的，所述PBS缓冲液的成分为NaCl137mmol/L，KC1 2. 7mmol/L， Na2HP044. 3mmol/L，KH2P041. 4mmol/L，pH为 7. 2-7. 4。
[0014] 进一步的，将绒毛膜剪碎成2-3mm3的组织块。
[0015] 进一步的，所述离心的操作条件为在500-650g条件下离心5-10min。
[0016] 进一步的，所述组织块沉淀与含10% -20 %体积FBS的DMEM培养基的体积比为 2. 5_3:1 〇
[0017] 进一步的，所述传代培养的培养基为L-DMEM和FBS，二者的体积比为9:1。
[0018] 进一步的，所述培养是在37°C、5%体积0)2的饱和湿度培养箱中。
[0019] 与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明采用改进的组织贴壁法，代 替传统的胎盘间充质干细胞分离的方法（即酶消化及灌注法），从而不需要分离出单个核 细胞进行培养，极大的简化了操作步骤，缩短了操作时间，获得同样数量的原代细胞，酶消 化需要3h左右，本发明仅需要30min左右的时间，为胎盘源间充质干细胞的规模化生产提 供了有力保障。
[0020] 通过PBS冲洗和红细胞裂解液的裂解，胎盘中污物和红细胞充分去除，避免了污 染和红细胞对间充质干细胞增殖的影响。确定了混匀组织块时添加培养基的最佳比例，避 免了培养基不足或多余对细胞培养的影响。通过STR(shorttandemrepeat，短片段重复序 列）检测，收获细胞全为单一来源的胎儿间充质干细胞，为细胞的临床应用提供了依据。
【附图说明】
[0021] 图1 :本发明中人胎盘源胎儿间充质干细胞的细胞形态图；
[0022] 其中A-C是本发明中获得的间充质干细胞原代第12、15、18天的细胞形态；D是间 充质干细胞第一代第3天的细胞形态；E是间充质干细胞第二代第3天的细胞形态；F是间 充质干细胞第三代第3天的细胞形态；
[0023] 图2:本发明中流式细胞术细胞表型分析图；
[0024] 图3 :本发明中细胞诱导分化图；其中A是成脂诱导分化，B是成骨诱导分化；
[0025] 图4 :本发明中STR检测图谱；其中A是胎儿脐带间充质干细胞（作为阳性对照） STR检测图谱，B是本发明培养的胎盘间充质干细胞。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
[0027] 本发明采用如下技术方案：一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法，包括以下步骤：
[0028] 1.胎盘源胎儿间充质干细胞分离方法：
[0029] 1)取新鲜胎盘，经过