一组特异识别金黄色葡萄球菌黄金亚种的寡核苷酸适配子的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品安全生物技术领域，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX 技术（指数富集的配体系统进化技术）筛选一种与金黄色葡萄球菌黄金亚种高特异性和高 亲和力结合的核苷酸适配子，为该核酸适配子在检金黄色葡萄球菌黄金亚种中的应用提供 科学依据和理论基础。
【背景技术】
[0002] 葡萄球菌（Staphylococcus)是革兰氏阳性球菌中的一种，广泛分布于空气、水、 土壤、饲料和人、动物的体表、鼻咽部及肠道，属于人畜共患病菌。其中金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)的致病力最强，常引起皮肤、组织及器官的化脓性炎症，由金黄 色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒是个世界性卫生问题。近年来，由金黄色葡萄球菌引起 的食物中毒越来越多，据美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒居第 二位，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则高达45%，中国每年发生此类中毒事件也 非常多，金黄色葡萄球菌作为一种重要的食源性致病菌，它对食品加工业及人们健康存在 着潜在的危害，因此急需建立一种快速、灵敏、准确的检测方法。
[0003] 金黄色葡萄球菌的检测包括生物学检测、分子生物检测、免疫学检测方法。传统的 细菌培养和生化鉴定耗时，灵敏度低而且操作繁琐；分子生物学检测比如PCR方法虽然快 速、准确，但干扰因素多、易受操作条件影响、重复性差是该方法普遍存在的问题；免疫学检 测具有特异性强、准确、灵敏的特点，但该技术受特异性抗体制备难度的制约，制备过程耗 时复杂，且抗体本身易受温度等环境因素的影响，因此发展快速、灵敏、准确的病原菌检测 技术十分必要。
[0004] 近年来，对寡核苷酸适配子的研究较为引人注目。寡核苷酸适配子是通过 SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment,指数富集的配体 系统进化技术）技术从体外合成的随机单链寡核苷酸文库中筛选得到的一簇小分子DNA或 RNA片段，能够以特定的结构与靶标高亲和力、高特异性的结合。作为抗体分子的前景性替 代分子，寡核苷酸适配子相比抗体分子表现出极大的优势：特异性高，亲和力强，体外合成 方便且成本低，易标记一些功能基团和报告分子，稳定性好，适配子变性与复性可逆且速度 快，可反复使用、长期保存。SELEX技术是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术， 是一种研究核酸结构和功能的有效方法，该技术问世之初Tuerk等人就采用SELEX技术筛 选出噬菌体T4DNA聚合酶的适配子。如今，适配子已经广泛地应用于靶标检测、酶抑制，受 体调节和药物传递等各种领域。随着SELEX技术的不断完善，适配子的靶标已经扩展到小 分子物质（有机染料，金属，药物，碳水化合物，氨基酸，核苷酸和肽等）、蛋白质（包括酶、抗 体、基因调控因子，以及外源凝集素）、肿瘤细胞、病毒和致病菌等。Cell-SELEX筛选以完整 细菌细胞为靶物质的筛选方法，近年来，采用Cell-SELEX技术已成功筛选出大肠杆菌、沙 门氏菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌等细菌的适配子，基于Cell-SELEX技术筛选病原致 病菌、肿瘤细胞等细胞的适配子已经成为该领域的研究热点。
[0005] 本发明以可引起皮肤软组织感染、败血症及导管相关性感染等多种疾病的金黄色 葡萄球菌黄金亚种为靶标，采用竞争Cell-SELEX技术筛选出金黄色葡萄球菌黄金亚种的 高特异性、高亲和力的适配子，该适配子稳定性高、可体外合成、易标记功能基团和报告分 子，将广泛应用于食品、临床中金黄色葡萄球菌黄金亚种的快速检测。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种微生物的分子生物学检测方法，特别涉及一种利用适配 子技术快速、准确检测金黄色葡萄球菌的方法。
[0007] 本发明方法利用指数级富集配体的系统进化技术（SELEX技术），以金黄色葡萄球 菌黄金亚种完整的活性菌细胞为靶标，筛选获得2条与靶细胞高亲和性、高特异结合的适 配子Spl5、Sp25,可以通过荧光基团标记方法将获得的适配子转为报告适配子，用于临床血 液样品、食品中金黄色葡萄球菌的检测，达到快速、准确诊断的目的。
[0008] 本发明的优点：
[0009] (1)与抗体相比，单链寡核苷酸更加稳定，适配子可在体外筛选，筛选周期短，合成 方便，易标记各种功能基团和报告分子，可长期保存使用。
[0010] (2)该组序列是从结构显著、与金黄色葡萄球菌黄金亚种结合具有不同亲和力的 8条适配子序列中选取出的亲和力和特异性均较强的一组适配子序列，能够特异识别金黄 色葡萄球菌黄金亚种。
【附图说明】
[0011] 图1是金黄色葡萄球菌黄金亚种8个适配子家族代表性序列的二级结构图谱。
[0012] 图2是金黄色葡萄球菌黄金亚种适配子Spll、Spl5、Sp25、Sp27亲和力饱和结合 曲线。
[0013] 图3是金黄色葡萄球菌黄金亚种适配子Spll、Spl5、Sp25、Sp27的特异性图。
[0014] 表1是金黄色葡萄球菌黄金亚种适配子解离常数Kd值。
【具体实施方式】：
[0015] 下面是通过cell-selex技术筛选高特异亲和的金黄色葡萄球菌黄金亚种核酸适 配子及其快速检出金黄色葡萄球菌黄金亚种方面的应用。
[0016] 1、体外合成随机单链DNA(ssDNA)文库和引物（IDT公司合成）
[0017] 随机单链DNA文库：5，-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTAC CGTGAA-3'，构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40个碱 基的随机序列，库容量达到1〇14以上；上游引物：5' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3' ;5'端磷 酸化下游引物：5 ^ - (phosphate) -ITCACGGTAGCACGCATAGG-3 ^，将随机ssDNA文库和两种 引物均用TE缓冲液配制成100ymol/L贮存液-20°C贮存备用。
[0018] 2、筛选所用金黄色葡萄球菌黄金亚种的获取与处理
[0019]LB液体培养基培养金黄色葡萄球菌黄金亚种，37 °C摇床培养至对数生长期 (1.OX108cfu/mL)。取对数生长期的金黄色葡萄球菌黄金亚种菌液lmL，在4°C，5000rpm