tGSTU19-R)，为了克隆鉴定等构建需要，引物两 端分别引入汉HI和feeI的酶切位点。
[0026]PCR反应体系：10XPCRbuffer5. 0y1;dNTPs(各 2. 5mM) 4y1;拟南芥cDNA 模版1yl(20ng);引物AtGSTU19-F0.5yl;引物AtGSTU19-R0.5yl;Ex-Taq0.4 u1 (预变性后加入）；加无菌水定容至50y1。
[0027]PCR反应程序：94 预变性 1min，94 变性 30s;55 退火 30s;72 延伸 1 min;共扩增30个循环，再72 °G延伸10min。
[0028](二）试验结果： 经过1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约600bp的片段（图2)。
[0029] 实施例3 克隆鉴定、序列测定 (一）试验方法： 扩增片段采用爱思进生物技术(杭州)有限公司DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，克 隆到大连宝生物工程有限公司的pMD-18-SimpleT载体上进行克隆鉴定和序列测定。
[0030] 本发明通过核苷酸序列测定分析，最终获得拟南芥抗逆相关基因AtGSTU19基因， 其碱基和氨基酸序列信息如SEQIDNo1和SEQIDNo2所示。
[0031](二）试验结果： 测序分析结果显示：拟南芥抗逆相关基因AtGSTU19编码阅读框长663bp，编码的蛋白 质含220个氨基酸。
[0032] 实施例4 AtGSTU19基因超量表达载体的构建 将实施例3中测序鉴定正确的含有序列表SEQIDNo1所示核苷酸的DNA片段用及洲1 和5^1进行双酶切，回收纯化后与含有双35S启动子和N0S终止子的pYPX245(Genbank: AY78049. 1)质粒连接，酶切鉴定和序列测定表明含有谷胱甘肽S-转移酶基因的植物表达 单元，将该表达单元插入植物表达载体pCambial301，构建拟南芥谷胱甘肽S-转移酶的植 物表达载体pCAM:AtGSTU19。该表达载体还包含⑶S报告基因和带内含子潮霉素抗性标记 基因。
[0033] 实施例5 拟南芥转化 (一）试验方法： 将实施例4构建的拟南芥谷胱甘肽S-转移酶的植物表达载体pCAM:AtGSTU19用蘸花 法转化拟南芥，具体方法如下： 1.农杆菌的准备： 1)将pCAM:AtGSTU19用电击法转化根癌农杆菌GV3101，或EHA105,或LBA4404菌株(BiovectorCo.，LTD)，得到含有pCAM:AtGSTU19的重组农杆菌，并涂布于含有卡那霉素抗 性的平板筛选转化子。
[0034] 2)挑取农杆菌单菌接种于5mLLB液体培养基(利福平50yg/mL，氯霉素100 yg/mL)中，28 °C，250rpm培养20h。
[0035] 3)取1mL菌液转接入20-30mLLB液体培养基(利福平50yg/mL，氯霉素100 yg/mL)中，28 °C，250rpm培养约 12h，测 0D600 ~ 1.5。
[0036] 4) 8000rpm，4 °C，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液（5%鹿糖， 0.05%SilwetL-77)并稀释至 0D600 ~ 0.8。
[0037] 2?拟南芥蘸花法转化： 1)将拟南芥的花薹浸入渗透液中，轻轻搅动约l〇s后取出，全部转化完毕后，用保鲜袋 罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置，22 °C避光培养，24h后去掉保鲜袋直立培养。
[0038] 2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花 序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。
[0039] 3)生长约两个月后，收集种子，4 °C冰箱储存待用。
[0040](二）试验结果： 经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。
[0041] 实施例6 拟南芥种子的筛选 (一）试验方法： 1)称25-30mg种子放入1. 5ml离心管。
[0042] 2) 1ml75%乙醇消毒1min(不停摇晃振荡)，8000rpm离心5s，去上清。
[0043] 3)加入1ml过滤后的漂白粉（2. 5%)消毒15min(不停摇晃振荡，充分消毒)， 8000rpm离心5s，去上清。
[0044] 4)无菌水洗涤3-4次。
[0045] 5)将种子均匀的播撒到1/2 MS平板(潮霉素50 y g/mL)上，Parafilm膜封口，4 °〇冰箱放置两天，22°C，16 h光照培养10天。
[0046] 6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株 0\)培养至开花结实，收集植株上所结t2种子。
[0047] 实施例7 抗逆相关基因AtGSTU19转化植株后的抗逆分析 (一）试验方法： 将转基因拟南芥自交纯和一代，选取3个纯合转化株系，收取种子。播种后，幼苗生长 10-20天，分别用NaCl和甘露醇处理，观察植株的耐盐，耐干旱、耐氧化胁迫的效果。
[0048] (二）试验结果： 结果表明：野生型和转AtGSTU19基因拟南芥在存活率上有明显的差异，转基因植株比 野生型拟南芥抗盐和抗干旱能力有明显提高。经过盐、干旱处理的转基因与野生型拟南芥 的存活率如表1所示。
[0049] 表1转基因与野生型拟南芥的盐、干旱处理后存活率
【主权项】
1. 一种拟南芥抗逆GST基因，其碱基序列如SEQIDNol。
2. 权利要求1所述的拟南芥抗逆GST基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDN〇2。
3. 根据权利要求1所述的拟南芥抗逆GST基因的制备方法，包括如下步骤： 拟南芥cDNA文库的构建，选取拟南芥幼苗提取总RNA，以总RNA为模板，Oligo(dT)为 引物，在AMV反转录酶的作用下合成cDNA; 设计一对引物，以上述cDNA为模板进行PCR扩增，获得拟南芥抗逆GST基因AtGSTU19 片段； 上述扩增片段回收后克隆入T载体，测序后获得拟南芥抗逆GST基因AtGSTU19。
4. 如权利要求1所述的基因在制备抗逆的转基因植物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种拟南芥谷胱甘肽S-转移酶基因及其编码蛋白在提高植物对盐、干旱胁迫的耐受性方面的应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID No1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。将含有拟南芥谷胱甘肽S-转移酶基因的核苷酸序列与外源启动子连接后转入拟南芥，转基因植物对上述胁迫的耐受性得到显著提高。
【IPC分类】C07K14-415, C12N15-29, C12N15-10, A01H5-00, C12N15-82
【公开号】CN104818284
【申请号】CN201510129698
【发明人】许晶, 田永生, 邢晓娟, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 高建杰, 付晓燕, 韩红娟, 王波, 王丽娟
【申请人】上海市农业科学院
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年3月24日