细胞穿透肽以及包含该肽的缀合物和组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及源自人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase ;hTERT)的细胞穿透肽、细胞穿透肽和活性成分的缀合物和包含该缀合物 的组合物。
【背景技术】
[0002] 尽管低分子量物质、核酸、蛋白质、纳米颗粒等在分子水平上具有作为治疗物质的 极大可能性，但低分子量物质、核酸、蛋白质、纳米颗粒等的使用由于无能力穿透组织和细 胞膜而受限。递送此类物质至细胞内的系统的发展已成为过去二十年来活跃的研宄领域。 在细胞内部运送物质已成为分子处理方法中的话题。将低分子量物质、核酸或纳米颗粒利 用若干试剂、电穿孔或热休克运送至细胞内部。然而，难以找到一种适当方法在不破坏蛋白 质的活性和完整性的情况下在细胞内部递送蛋白质。在20世纪80年代，在对人类免疫缺 陷性病毒（human immunodeficiency virus ;HIV)的细胞穿透能力进行的研宄中，已发现， 由特定的11种氨基酸组成的HIV-TAT蛋白质在于细胞内部的运送过程中起重要作用。因 此，在20世纪90年代，探索在细胞内部运送蛋白质的恰当方法的研宄成为重点研宄领域。
[0003] 已知端粒是染色体末端发现的遗传物质重复序列，端粒防止染色体损伤或合并至 其它染色体上。端粒的长度在每次细胞分裂时缩短，且在一定次数的细胞分裂之后，端粒长 度极端缩短至细胞停止分裂且死亡的程度。在另一方面，已知端粒延伸延长细胞的寿命。作 为实例，癌细胞分泌被称为端粒酶的酶，该酶防止端粒缩短，因此导致癌细胞增殖。。
【发明内容】
[0004] 本发明的目标在于提供一种细胞穿透肽。
[0005] 本发明的另一目标在于提供作为细胞内的活性成分的载体的有用肽。
[0006] 本发明的另一目标在于提供作为细胞内的活性成分的载体的有用肽，尤其是将活 性成分局部地递送至线粒体的有用肽。
[0007] 本发明的另一目标在于提供用于递送活性成分至线粒体以改善、预防或治疗线粒 体相关的疾病或病症的有用肽。
[0008] 本发明的另一目标在于提供活性成分和细胞穿透肽缀合成的缀合物。
[0009] 本发明的另一目标在于提供包含活性成分和细胞穿透肽的缀合物的组合物。
[0010] 本发明的另一目标在于提供包含活性成分和细胞穿透肽的缀合物的药物组合物。
[0011] 本发明的另一目标在于提供包含活性成分和细胞穿透肽的缀合物的功能性化妆 组合物。
[0012] 本发明的另一目标在于提供包含活性成分和细胞穿透肽的缀合物的健康食品组 合物。
[0013] 本发明的另一目标在于提供包含活性成分和细胞穿透肽的缀合物的对比造影剂。
[0014] 根据本发明的一个实施例的缀合物可为细胞穿透运载肽和活性成分的缀合物，其 中运载肽为包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的肽、具有与上述序列超过80%同源性的氨基 酸序列的肽或上述肽的片段，且其中具有与上述序列超过80%同源性的氨基酸序列的肽和 上述肽的片段为保持SEQ ID NO: 1的细胞穿透能力的肽。
[0015] 根据本发明中的缀合物的另一个实施方式，片段可由三个或更多氨基酸组成。
[0016] 根据本发明中的缀合物的另一个实施方式，运载肽可由三十个或更少氨基酸组 成。
[0017] 根据本发明中的缀合物的另一个实施方式，上述运载肽可为具有SEQ ID NO: 1的 氨基酸序列的肽或具有与上述序列超过80%同源性的氨基酸序列的肽。
[0018] 根据本发明的一个实施方式的对比造影剂可包含上述的任一种缀合物。
[0019] 根据本发明的一个实施方式的对比造影剂可用于进行细胞对比造影。
[0020] 根据本发明的对比造影剂的另一个实施方式，细胞可为干细胞。
[0021] 根据本发明的一个实施方式的组合物可包含上述的任一种缀合物。
[0022] 根据本发明中的组合物的另一个实施方式，活性成分可用于治疗或预防疾病，且 组合物可为药物组合物。
[0023] 根据本发明的组合物的另一个实施方式，活性成分可为用于功能性化妆品的活性 成分，且组合物可为化妆品组合物。
[0024] 根据本发明的组合物的另一个实施方式，活性成分可为用于功能健康食品的活性 成分，且组合物可为健康食品组合物。
[0025] 根据本发明的一个实施方式的活性成分的细胞质革巴向递送系统（targeting delivery system)可包含上述的任一种缀合物，其中运载肽局部地移动至细胞质内且起到 局部地递送所述活性成分至细胞质内的作用，其中具有与上述序列超过80%同源性的氨基 酸序列的肽和该肽的片段为保持SEQ ID NO: 1的细胞穿透能力的肽。
[0026] 根据本发明的一个实施方式的活性成分的线粒体靶向递送系统可包含上述的任 一种缀合物，其中运载肽局部地移动至线粒体内且起到局部地递送所述活性成分至线粒体 内的作用，其中具有与上述序列超过80%同源性的氨基酸序列的肽和该肽的片段为保持 SEQ ID NO: 1的细胞穿透能力的肽。
[0027] 根据本发明的一个实施方式用于调节线粒体活性的组合物可包含上述的任一种 缀合物，其中运载肽局部地移动至线粒体内且起到局部地递送所述活性成分至线粒体内的 作用，其中具有与上述序列超过80%同源性的氨基酸序列的肽和该肽的片段为保持SEQ ID NO: 1的细胞穿透能力的肽。
[0028] 根据本发明的用于调节线粒体活性的组合物的另一个实施方式，组合物可为用于 与线粒体有关的疾病或病症的治疗、预防、进展抑制或症状缓和的药物组合物，且活性成分 为用于与线粒体有关的疾病或病症的治疗、预防、进展抑制或症状缓和的成分。
[0029] 根据本发明的一个实施例的方法可为一种递送活性成分至细胞内的方法，其中该 方法包含对需要的受试对象施用任一种上述缀合物的步骤，且其中运载肽为执行将活性成 分递送至细胞内的细胞穿透肽，且其中具有与序列超过80%同源性的氨基酸序列的肽和序 列的片段可为保持SEQ ID NO: 1的肽的细胞穿透能力的肽。
[0030] 根据本发明的方法的另一个实施方式，该方法可用于在细胞内部局部地递送活性 成分至线粒体内。
[0031] 根据本发明的肽可包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或上述肽的片段。SEQ ID NO: I 的片段可由3至7个氨基酸组成。
[0032] 根据本发明的肽可为具有包含SEQ ID NO: 1的超过17个氨基酸的细胞穿透肽。
[0033] 根据本发明的多核苷酸可编码上述细胞穿透肽。
[0034] 根据本发明的载体可包含上述多核苷酸。
[0035] 根据本发明的转化细胞可包含上述载体。
[0036] 产业利用性
[0037] 难以在细胞内部运送的活性成分可通过使用本发明所公开的肽或肽和活性成分 的缀合物而易于在细胞内部运送。此意味着可增加活性成分的功效且因此可减少活性成分 的剂量。因此，可最小化由于投药造成的副作用且可增加治疗的有效性。特别地，当将药物 局部地递送至线粒体内时，可改善线粒体相关的疾病或病症，且可增加预防和治疗疾病的 有效性。在化妆品的情况中，利用少量活性成分可产生显著效应。通过使肽与对比造影物质 缀合，可将该肽用作对比造影物质以监测细胞移植的过程或在细胞处理中的移植细胞。特 别地，该肽可实际上用作用于注入体内的干细胞的对比造影物质。
【附图说明】
[0038] 图1表示在具有限制性酶切位点（EcoRI和HindIII)的pET28a载体中产生的绿 色焚光蛋白（green fluorescence pro