用于蛋白产生的哺乳动物细胞培养过程的制作方法
【专利说明】用于蛋白产生的晡乳动物细胞培养过程 发明领域
[0001] 本发明涉及用于培养哺乳动物细胞的新过程，所述哺乳动物细胞产生蛋白产物。 所述细胞培养过程的进行导致高细胞活力和/或细胞密度，并且也可以导致高产物品质和 生产率。
[0002] 发明背景 优选使用动物细胞培养，尤其是哺乳动物细胞培养用于表达用于治疗性和/或预防性 应用的重组产生的蛋白。
[0003] 通常，在基于哺乳动物细胞培养的系统中的蛋白表达水平显著低于微生物表达系 统（例如细菌或酵母表达系统）。然而，细菌和酵母细胞的以下能力有限：最佳表达高分子 量蛋白产物、正确折叠具有复杂立体结构的蛋白、和/或提供成熟所表达糖蛋白必需的翻 译后修饰，由此影响产物的免疫原性和清除率。
[0004] 由于培养动物或哺乳动物细胞，特别是产生重组产物的动物或哺乳动物细胞的限 制，已研宄了多种参数的操作，包括采用大规模培养容器；改变基本培养条件，诸如孵育温 度、溶解氧浓度、PH等；使用不同类型的培养基和对于培养基的添加剂；和增加所培养细胞 的密度。此外，用于哺乳动物细胞培养的过程开发会受益于延长运行时间的能力的进步，以 增加终产物浓度，同时维持高产物品质。细胞培养过程，特别是非连续性过程的运行时间通 常受限于细胞的剩余活力，这通常随着运行过程而下降。因此期望高细胞活力的最大可能 延长，同时维持产物品质。蛋白纯化问题（concerns)为最大限度地降低活细胞密度和维持 高细胞活力提供了另一个动机。培养物中细胞碎片和死细胞内容物的存在可以对在培养运 行结束时分离和/或纯化蛋白产物的能力造成负面影响。通过使细胞在培养中维持活力较 长时间段，由此存在细胞蛋白和酶对培养基污染的伴随减少，所述污染可以引起通过细胞 产生的期望蛋白的降解和品质的最终降低。
[0005] 已研宄多种参数以在细胞培养中达到高细胞活力。一种参数涉及在37°C初始 培养后单独降低培养温度（例如，Roessler等人，你好膨 18:423-427 (1996) ;Etcheverry, ?\ 等人（1998)的美国专利号 5, 705, 364和 5, 721，121; Furukawa, Κ.等人（1999)的美国专利号5, 976, 833 ;Adamson, L.等人的美国专利 号 5,851,800 ;Genentech, Inc.的 WO 99/61650 和 WO 00/65070 ;Biogen, Inc.的 WO 00/36092和Girard等人的美国专利号4, 357, 422)。
[0006] 所研宄的其他参数涉及向培养物中添加组分。发现向CHO 111-10PF细胞系中添 加硫酸葡聚糖和聚乙稀硫酸盐（polyvinyl sulfate)相对于对照培养物增加第3天活细胞 密度和活力（Zhangi 等人，SioiecAfloJr. /?-!?1;, 16:319-325 (2000))。然而，未报道硫酸 葡聚糖或聚乙烯硫酸盐在死亡期过程中的效应。还报道硫酸葡聚糖和聚乙烯硫酸盐在防止 细胞聚集方面是有效的。
[0007] 由于其大小、结构复杂性和生物生产的性质，蛋白治疗剂是固有异质的（Chirino 等人，她i. SiotecAz7O乂，22:1383-1391 (2004))。甚至在"纯"蛋白溶液中，也存在一 定百分比的低分子量片段、高分子量种类和不同程度的化学修饰。高分子量种类的形成 通常是由于蛋白聚集，其是在制造生物制品过程中遇到的常见问题。通常，认为聚集体的 存在是不期望的，因为担忧聚集体可以导致免疫原性反应或可以在施用时引起不良事件 (Cromwell等人，以8:E572-E579 (2006))。尽管一些类型的生物制品聚集体可以 正常发挥功能，但维持产物品质的一致性仍然重要，因为产物一致性是监管审批的先决条 件。
[0008] 蛋白聚集体可以由于几种机制产生，且可以在制造过程期间的每一阶段发生。在 细胞培养中，分泌蛋白可以暴露于不利于蛋白稳定性的条件；但更经常地，由于未折叠蛋白 分子的相互作用或通过负责正确折叠的分子伴侣对新生肽链的无效识别，大量蛋白的积累 可以导致细胞内聚集（Cromwell等人，以，8:E572-E579 (2006))。在细胞的内质 网（ER)中，新合成蛋白的二硫键在氧化环境中形成。在正常条件下，蛋白巯基可逆地氧化 为蛋白二硫化物和次磺酸，但更高氧化态诸如蛋白半胱氨酸的亚磺酸和磺酸形式是不可逆 的（Thomas等人，/??. 36:1519-1526 (2001))。过氧化蛋白可以含有不正确 的二硫键或具有与其他内腔ER蛋白的混合二硫键；在任一情况下，其导致蛋白不正确的折 叠和聚集。因此在ER中维持适当受控的氧化环境是至关重要的。在这点上，Cu0zz0等人 OVai. 沿〇乂，1:130-135 (1999))首先证实，在酵母中，谷胱甘肽可以针对ER过氧 化进行缓冲，且后来由Chakravarthi等人U沿〇又泛6?·，279:39872-39879 (2004)) 证实，在哺乳动物细胞中，也需要谷胱甘肽来调节进入分泌途径的蛋白内天然二硫键的形 成。
[0009] 随着培养物中产物浓度的增加，在细胞培养过程中可以观察到产物品质降低。培 养中细胞产生的蛋白的高丰度最佳地伴随蛋白的高品质，所述蛋白最终回收用于预期用 途。
[0010] 重组产生的蛋白产物对于用作治疗剂、治疗和预防剂在医学和临床上变得越来越 重要。因此，可靠细胞培养过程的开发满足本领域中的期望和所需的目标，所述细胞培养过 程经济且有效地达到与高水平的产物品质结合的最终蛋白产物浓度增加。
[0011] 发明概述 本发明提供通过动物或哺乳动物细胞培养用于产生蛋白的新过程。这些新过程达到增 加的活细胞密度、细胞活力、生产率和降低的蛋白聚集。
[0012] 本发明的一个方面涉及在整个培养过程中在不含生长因子/蛋白/肽的培养基中 细胞生长。在这个方面，本发明的细胞培养过程可以有利地达到由经培养的细胞产生的蛋 白的增强的比生产率。更具体地，根据本发明，在细胞培养期过程中利用的不含生长因子/ 蛋白/肽的培养基维持培养物中细胞的高细胞活力，且可以在整个培养运行中提供高数量 和品质的所产生产物。同样，根据本发明的一个方面，在培养过程中利用的不含生长因子/ 蛋白/肽的培养基可以有利地允许延长培养的生产期。在延长的生产期过程中，期望产物 的滴度增加；产物品质维持在高水平；蛋白聚集水平维持在较低水平且细胞活力也维持在 高水平。此外，与本发明的培养过程有关的延长的生产期允许产物生产超过在标准生产期 过程中产生的产物生产。
[0013] 本发明的另一个方面涉及在接种后将一种或多种生长因子添加至不含生长因子/ 蛋白/肽的细胞培养物。根据本发明，在接种后将一种或多种生长因子添加至不含生长因 子/蛋白/肽的细胞培养物维持培养物中的细胞的高细胞活力，并且可以在整个培养运行 中提供高数量和品质的所生产产物。在生长因子补料细胞培养的产生阶段过程中，期望产 物的滴度增加；产品品质维持在高水平；蛋白聚集水平维持在较低水平且细胞活力也维持 在尚水平。
[0014] 在一个具体方面，本发明提供这样的过程（或方法），其中通过在补料培养基中添 加胰岛素和/或IGF来降低蛋白聚集水平。根据这个具体方面，添加胰岛素和或IGF维持 培养物的高细胞活力，由此产物优选重组产物的滴度增加，并且产物品质维持在高水平。
[0015] 在本发明的一个方面，在接种时或在接种后的初始死亡期开始前、或初始生长期 过程中、或初始生长期的后半部分过程中、或初始生长期结束时或约结束的时候，将一种或 多种生长因子添加至培养物。根据本发明的这个方面，生长期延长一段时间和/或死亡期 的开始延迟一段时间，诸如几天。<