活性工程酵母的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物科学技术领域，尤其是一种活性工程酵母的制备方法。
【背景技术】
[0002]酿酒酵母(cerevisiae)是一种良好的营养与保健饲料添加剂，其活性与功能密切相关。作为最早用于基因工程的酵母菌株，酿酒酵母表达的重组蛋白能有效保持生物学活性，人类已经获得一些通过酿酒酵母表达系统生产的重要药用蛋白(宋宏新等，2001)。鸡γ干扰素(ChIFN-γ )具有高效免疫调节、抗病毒、抗肿瘤细胞增殖、提高抗逆性和促进生长等多种重要生理功用，是养禽业中防治鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊、减蛋综合征等多种病毒性传染病的重要药物。对表达具有极高临床价值的ChIFN-γ活性酿酒酵母工程菌进行生产，用于家禽饲料添加剂，可以实现畜牧业中干扰素的便利、低成本供给和产业化生产等问题。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是:提供一种活性工程酵母的制备方法，它能获得具有高活性，且可供制备活性酵母干粉的工程菌，以克服现有技术的不足。
[0004]本发明是这样实现的:活性工程酵母的制备方法，包括下列步骤:
1)工程菌株的发酵:利用SC选择培养基进行工程菌筛选，将基因工程酵母菌株接种于SC选择培养基上，在30°C下倒置培养至单菌落长出后，挑取活化后的单菌落于YPD酵母菌完全液体培养基中过夜培养；
2)重组蛋白的诱导表达:利用质量百分比浓度为3%的半乳糖溶液作为诱导剂作为诱导剂，将过夜活化培养的菌种接种到诱导培养基中，使其0D_为0.4，并在30°C、200rpm的条件下振荡培养，实现诱导重组蛋白的表达；
3)表达蛋白检测:利用聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫吸附试验和质谱相结合的方式检测重组蛋白的表达情况；
4)工程菌的真空冷冻干燥:将诱导表达的菌液在5000rpm下离心20min，收集菌体，加入保护剂并混合均匀后进行真空冷冻干燥，通过菌体含水量测定和显微镜检测相结合进行干燥工艺参数的控制工程酵母菌粉的含水量为5-6%，显微镜检测的标准是，工程酵母菌粉的细胞存活率为75以上％ ；；
5)活性酵母检测:以存活率为指标，利用血球计数板法进行活菌计数；通过对复性后的制备干粉酵母的不同时段的生长曲线测定和活菌数统计，判断制备酵母的活性质量，BP复性后的工程酵母细胞形态正常与否和存活率。
[0005]步骤4)中所述的保护剂中包括质量百分比浓度为12-16g/100mL的脱脂奶粉、质量百分比浓度为12-16g/100mL蔗糖以及质量百分比浓度为1.0-1.3g/100mL聚乙二醇，其余为水。
[0006]步骤4)所述的真空冷冻干燥为，先在-80°C预冷冻lh，放入真空冷冻干燥机进行干燥，温度为-80°C，真空度为3?lOPa，干燥时间为8 -10 h。
[0007]由于采用了以上技术方案，与现有技术相比，本发明通过真空冷冻干燥法对诱导表达的基因工程酿酒酵母进行干燥制备，生产含有鸡干扰素药用蛋白的饲用微生态制剂。本发明制备获得的饲用工程酵母菌存活率高达80.81%，这为生产酵母添加剂进行家禽疫病防治奠定了工艺基础。本发明方法简单易行，成本低廉，使用效果好。
【附图说明】
[0008]图1 INVSCl/pYEIFNG工程菌株裂解蛋白的SDS-PAGE电泳检测；
图1中，Μ:标准分子量蛋白；1: JyVKStl菌株；2、3: J#KStl/pYEIFNG13菌株；
图2 rChIFNG表达蛋白的ELISA检测；
图3 INVSCl/pYEIFNG13重组蛋白的质谱检测图谱；
图4样品酵母在真空冷冻干燥过程中的含水量变化；
图5真空冷冻干燥制备的酵母干粉及其显微活性观察；
图6活性酵母的生长曲线。
【具体实施方式】
[0009]本发明的实施例1:活性工程酵母的制备方法，
1.菌株
ChIFN-γ基因工程酿酒酵母J#KSbl/ChIFNG菌株为贵州大学农业生物工程研宄院创制保存。
[0010]2.工程菌株的筛选培养
Cl) INVScl/OiWm保种菌株于Ura缺陷SC酵母筛选培养基平板中划线活化，28°C培养24?48ho
[0011](2)挑取活化的酵母单菌落于15 mL SC选择培养基中，置30°C、200r/min过夜振荡培养，测定菌液0D_值。
[0012]3.酵母工程菌的诱导表达
(I)SC菌体培养液于1500Xg、常温离心5 min，弃上清后的沉淀重悬于50 mL已添加半乳糖的YPD诱导培养基中，并保证最终0D_=0.4。
[0013](2)菌体重悬液于30°C、200r/min过夜振荡培养12h，测定006(|(|数值后，1500 X g、4°C离心5min，弃上清。
[0014](3)用500 μ L灭菌水重悬细胞后，10000 r/min离心30 S，弃上清，菌体-80°C
保存备用。
[0015]4.干扰素重组蛋白的检测
(I)酵母细胞裂解
a将_80°C诱导重组蛋白后的工程菌体取出，重悬于500 μ L裂解缓冲液中，1500 X g、4 °C离心5 min，弃上清。
[0016]b根据以上3 (2)步骤中诱导培养基菌液0D_数值，加入适量的裂解液重悬菌体沉淀，使其 0D6QQ=50~100o
[0017]c加入等体积的酸洗玻璃珠，涡旋振荡30s后冰浴30s，重复4次该过程以充分裂解细胞。
[0018]d裂解细胞液于4 oCU0000 r/min，离心lOmin，上清置-20°C保存备用。
[0019](2) SDS-PAGE电泳检测表达产物
a样品处理:上述4 (l)d步骤中制备的酵母细胞裂解液上清加入等体积的2X SDS-PAGE 样品处理液(50mM pH 6.8 Tris-HCl，5% 巯基乙醇，2%SDS，0.1% 溴酚蓝，10%甘油)，沸水浴中煮10 min后，10000 r/min离心2min，取上清液上样电泳。
[0020]b采用5%浓缩胶、12%分离胶，120V浓缩胶、200V分离胶电泳Ih后，染色液(45%甲醇，10%乙酸，0.25%考马斯亮蓝R-250)常温过夜染色。弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗2~3次，然后加入脱色液(25%甲醇，10%乙酸)，脱色3~4次至背景清晰透明。
[0021](3)重组蛋白的酶联免疫吸附试验(ELISA)定量分析
采用上述4(1)所述方法制备工程酵母蛋白裂解液，使用美国RB公司的Ch