一种类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT2及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT2及其编 码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 波罗蜜（ArtocarpusheterophyllusLam.)属于桑科水果类植物，主要种植于热 带、亚热带区域。果实香味浓郁，酸甜可口，深受我国南方消费者的青睐。波罗蜜不仅是一 种特色水果资源，其枝叶组织富含一类特殊结构的黄酮类物质，即异戊烯基类黄酮。该种黄 酮类物质比常见结构的黄酮类物质生物活性更强，例如其在抑制肿瘤细胞增殖活性、免疫 调节活性等方面，均比没有异戊烯基化的黄酮类物质更显著。波罗蜜组织中异戊烯基类黄 酮的含量不仅高，而且结构种类丰富，目前已发现有二十余种不同结构形式的异戊烯基类 黄酮。由此可见，波罗蜜既是丰富的异戊烯基类黄酮天然资源，也是类黄酮异戊烯基转移酶 的丰富资源。异戊烯基类黄酮在肿瘤等疾病治疗方面具有非常重要的价值，具有广泛的应 用前景。因此，利用菠萝蜜固有的天然优势，通过生物技术的手段来开发一种生物合成异戊 烯基类黄酮的方法将具有重要的产业价值。
【发明内容】
[0003] 本发明的第一个目的是提供一种类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT2及其编码基因 AhFDT2。
[0004] 本发明的类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT2,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0005] 本发明还提供了编码上述类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT2的类黄酮异戊烯基转移 酶基因AhFDT2,其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0006] 本发明的第二个目的是提供类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT2在制备异戊烯基类黄 酮中的应用。
[0007] 所述的应用优选是将芹菜素加入超量表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT2的酿酒 酵母菌液中，经类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT2催化产生异戊烯基芹菜素。
[0008] 所述的应用优选是以类黄酮和异戊烯基供体作为底物，经类黄酮异戊烯基转移酶 AhFDT2催化产生异戊烯基类黄酮。
[0009] 优选，所述的催化，其反应体系的pH值为7~9,反应温度为20~40°C。
[0010] 优选，所述的类黄酮为芹菜素，所述的异戊烯基供体为二甲基丙烯基焦磷酸，经类 黄酮异戊烯基转移酶AhFDT2催化产生异戊烯基芹菜素。
[0011] 优选，所述的类黄酮为山奈酚，所述的异戊烯基供体为二甲基丙烯基焦磷酸，经类 黄酮异戊烯基转移酶AhFDT2催化产生异戊烯基山奈酚。
[0012] 本发明从菠萝蜜中克隆得到类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT2,其编码的类黄酮 异戊烯基转移酶AhFDT2具有良好的催化合成异戊烯基类黄酮的活性。通过利用类黄酮异 戊烯基转移酶基因AhFDT2构建表达载体转化酿酒酵母，获得超量表达类黄酮异戊烯基转 移酶AhFDT2的酿酒酵母；利用其菌液或微粒体催化异戊烯基供体和类黄酮底物合成异戊 烯基类黄酮，转化率可高达26%，产物纯度可达76-95%。本发明为异戊烯基类黄酮的生物 合成提供了一种新的方法，具有操作简便，反应污染小，产物纯度高等优势。
【附图说明】
[0013]图1是异戊烯基芹菜素的一级质谱图。
[0014] 图2是异戊烯基芹菜素的二级质谱图。
[0015] 图3是酿酒酵母阳性菌的菌落PCR产物电泳图。
[0016] 图4是异戊烯基山奈酚的一级质谱图。
[0017] 图5是异戊烯基山奈酚的二级质谱图。
【具体实施方式】
[0018] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0019] 下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行。
[0020] 实施例1 :克隆类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT2、构建超表达载体及转化酿酒 酵母
[0021] 提取波罗蜜叶片的RNA，采用逆转录酶M-MLV，逆转录反应合成的 cDNA。以该cDNA为模板，采用正向引物GCCACCATGGAGCTCTCAATTTCT，反向引物 TATGAATGGAAATAAGAAAAATTCTGCA，TakaRa公司ExTaqDNA聚合酶，进行PCR扩增；PCR条 件为：94°C，5min;94°C，45s、55°C，lmin、72°C，1. 5min;35 个循环；72°C延伸lOmin。采用琼 脂糖凝胶电泳回收目的片段，将目的片段送交测序。经测序分析，克隆得到的类黄酮异戊烯 基转移酶基因AhFDT2,其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，其含有1209个碱基，编码的蛋 白命名为类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT2,共402个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQIDNO. 2 所示。
[0022] 连接类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT2至超表达载体pYes2. 1T0P0(购自 Invitrogen公司，货号K4150-01)上，连接反应条件为：类黄酮异戊烯基转移酶基因 AhFDT2、质粒pYES2. 1T0P0、1. 2MNaCl、0. 06MMgClJg合后，室温放置 30min完成连接反 应，获得重组质粒（类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT2插入到超表达载体pYes2. 1T0P0 后的重组质粒）。然后将其再转化至酿酒酵母感受态细胞中，转化条件为：向酵母感受态 细胞中加入2yL重组质粒、5yL鲑鱼精DNA，混匀；加入600yL转化液（转化液配方为： lmL50%PEG，125yL10XTE，125yL10\1^六。），301：、100卬111摇床转化30111111;加入 70yLDMS0 (二甲基亚砜），42°C热激15min;冰浴放置2min后13000rpm离心5s，加200yL IXTE悬浮细胞，涂布SC-U抑制平板，30 °C培养3~5天。菌落PCR筛选重组质粒成功 转化至酿酒酵母细胞的阳性菌，筛选方法为：挑选单个菌落转移至50yL无菌水，100°C加 热5min，离心去除细胞碎片；取10yL上清液，加入5yLExTaqDNA聚合酶缓冲液、1yL 10mMdNTPs，1yL正向引物GCCACCATGGAGCTCTCAATTTCT，1yL来自质粒序列的反向引物 ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT，0. 5yLExTaqDNA聚合酶，31. 5yL无菌水，混合；PCR程序为： 94°C，5min;94°C，40s;55°C，40s;72°C，1. 5min;35 个循环；72°C延伸 10min。PCR产物用琼 脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，图3的M为marker，1为阳性菌，该阳性菌能够扩增出 目的片段，表明类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT2插入到超表达载体pYes2. 1T0P0后的重 组质粒成功转化至酿酒酵母细胞，再经测序验证确认，由此得到将类黄酮异戊烯基转移酶 基因AhFDT2插入到超表达载体pYes2. 1T0P0后的重组质粒成功转化至酿酒酵母细胞的阳 性菌，命名为酿酒酵母pYes2.lT0P0-AhFDT2。对酿酒酵母pYes2.lT0P0-AhFDT2进行大量 培养，首先挑酿酒酵母口￥682.11'0?041^012转移至501^3(：1抑制培养基（2%葡萄糖为 碳源），30°0,200印111，培养至对数生长期；离心收集细胞，用3(：1诱导培养基（2%半乳糖， 1 %棉子糖为碳源）稀释至0D600 = 0? 4, 30°C，200rpm，培养24h。用SC-U诱导培养基培养 酿酒酵母pYes2.lT0P0-AhFDT2,诱导其超量表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT2,即获得超 量表达类黄酮异戊烯基转移酶AhFDT2的酿酒酵母菌液。
[0023] 实施例2:合成类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT2、构建超表达载体及转化酿酒 酵母
[0024] 采用全合成的方法直接合成类黄酮异戊烯基转移酶基因AhFDT2全长序列 (具体如SEQIDNO. 1所示），按照实施例1的方法连接类黄酮异戊烯基转移酶基因 AhFDT2至超表达载体pYes2.1T0P0上，再转化至酿酒酵母感受态细胞中，得到酿酒酵母 pYes2.lT0P0-AhFDT2。将酿酒酵母pYes2.lT0P0-AhFDT2进行大量培养，诱导超量表达类黄