一种微生物转化制备姜黄素糖苷化产物的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品和药品技术领域，尤其涉及一种微生物转化制备姜黄素糖苷化产物的方法。
【背景技术】
[0002]姜黄为姜科姜黄属植物姜黄(Curcuma longa L.)的干燥根莖，主要用于食品及色素，主产于中国、印度、日本等国家。姜黄素(Curcumin)为其中提取得到的一种具有独特的1，7_ 二芳基庚酸基本骨架的多酚性色素，是姜黄中主要活性成分之一。由于其色泽稳定且毒性很低，被广泛应用于食品添加剂和染料。现代药理学研宄证明姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、利胆、抗肝细胞毒性、抗风湿、抑菌、抗低血压、低胆固醇以及抗老年痴呆症等广泛的药理作用。同时由于其在较大剂量情况下对人体安全性仍较高，因此被美国FDA批准进入了一期临床试验，且有望开发为新型的化学预防药。
[0003]由于姜黄素水溶性差、结构不稳定，使它在食品和药品领域中的应用受到较大的限制。其在酸性和中性pH环境中几乎不溶，只溶于丙酮等少数有机溶剂，且久置或光照容易分解。因此虽然姜黄素是一种有效的抗癌药物，但其选择性低、药效不持久、被机体吸收的能力差，导致其生物可利用度低，这些不足严重影响了它的临床应用。基于此，在保持姜黄素原有药效的基础上合成新的姜黄素衍生物与类似物就成了近期研宄的热点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种微生物转化制备姜黄素糖苷化产物的方法，旨在解决姜黄素水溶性差导致的生物利用度低问题。
[0005]本发明是这样实现的，一种微生物转化制备姜黄素糖苷化产物的方法，该微生物转化制备姜黄素糖苷化产物的方法包括:
[0006]步骤一，华根霉R.chinensis菌丝生长旺盛时，按照每瓶5-15mg剂量，加入姜黄素底物；
[0007]步骤二，姜黄素底物加入菌液中共培养4-8天后，减压抽滤除去菌丝，滤液以等体积乙酸乙酯萃取3次，有机相合并，减压浓缩至干；
[0008]步骤三，残渣经硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇100: 1，50:1和10: l，v/v的梯度洗脱，得到产物；
[0009]进一步，步骤一中的华根霉R.chinensis接种于液体PDA培养基，摇床上避光培养24，使微生物大量繁殖。
[0010]进一步，PDA培养基的制备方法:
[0011]取去皮马铃薯200g，切成小块，置烧杯中加水1.0L煮沸30min，滤除马铃薯块，将葡萄糖20g加入滤液中，搅拌至完全溶解，再补足滤液至1L，自然pH即可，固体斜面培养基另加2.5%琼脂；
[0012]进一步，该微生物转化制备姜黄素糖苷化产物的方法包括以下步骤:
[0013]步骤一，将菌株在无菌条件下接入培养基中，250mL三角瓶，装80mL液体培养基，25°C下于180rpm摇床上避光培养；
[0014]步骤二，当菌丝生长旺盛时，按照每瓶5_15mg剂量，加入姜黄素底物；
[0015]步骤三，底物加入菌液中共培养4-8天后，减压抽滤除去菌丝，滤液以等体积乙酸乙酯萃取3次。有机相合并，减压浓缩至干；
[0016]步骤四，残渣经硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇100: 1,50:1和10: l，v/v的梯度洗脱，得到产物。
[0017]进一步，该微生物转化制备姜黄素糖苷化产物的方法包括以下步骤:
[0018]步骤一，将华根霉R.chinensis接种于250mL三角瓶中，每瓶盛80mL液体培养基，25°C下于180rpm摇床上避光培养24h，吸取其中5mL菌液置于100mL三角瓶中，每瓶盛380mL液体培养基，25°C下于180rpm摇床上避光培养；
[0019]步骤二，当菌丝生长旺盛时，按照每瓶l_3mg剂量，加入姜黄素底物；
[0020]步骤三，底物加入菌液中共培养4-8天后，减压抽滤除去菌丝，滤液以等体积乙酸乙酯萃取3次，有机相合并，减压浓缩至干；
[0021]步骤四，残渣经硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇100: 1,50:1和10: l，v/v的梯度洗脱，得到产物。
[0022]本发明的R.chinensis IFFI 3043对姜黄素的转化能力很强，减压抽滤很好地除去了菌丝，梯度洗脱使产物得到较好的分离和收集，培养8h后约有57%姜黄素底物转化成姜黄素V -Ο-β-D-葡萄糖苷；PDA培养基能够为华根霉R.chinensis的生长过程提供所需的营养物质，使微生物能够快速稳定的生长，生长状态良好，易于产物提取，生物转化率高。此外，本发明的方法简单，操作方便，较好的解决了姜黄素水溶性差导致的生物利用度低问题。
【附图说明】
[0023]图1是本发明实施例提供的微生物转化制备姜黄素糖苷化产物的方法流程图；
[0024]图2是本发明实施例提供的生物转化样本的HPLC图谱示意图；
[0025]图3是本发明实施例提供的Rhizopus chinensis IFFI 3043转化姜黄素动力学示意图；
[0026]图4是本发明实施例提供的糖苷化产物的抗肿瘤活性评价。
【具体实施方式】
[0027]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0028]下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0029]本发明实施例中所使用的微生物为华根霉Rhizopus chinensis IFFI 3043，购自中国食品发酵工业研宄院。
[0030]如图1所示，本发明实施例的微生物转化法制备姜黄素糖苷化产物的方法，包括以下步骤:
[0031]SlOl:华根霉R.chinensis接种于液体PDA培养基，摇床上避光培养24h ；
[0032]S102:当菌丝生长旺盛时，加入姜黄素底物继续培养；
[0033]S103:减压抽滤除去菌丝，滤液以等体积乙酸乙酯萃取，有机相合并，减压浓缩至干;
[0034]S104:残渣经硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇梯度洗脱，得到姜黄素糖苷化产物。
[0035]本发明的具体实施例:
[0036]实施例中的PDA培养基:取去皮马铃薯200g，切成小块，置烧杯中加水1.0L煮沸30min，滤除马铃薯块，将葡萄糖20g加入滤液中，搅拌至完全溶解，再补足滤液至1L，自然pH即可，固体斜面培养基另加2.5%琼脂。
[0037]实施例1
[0038]一种微生物转化法制备姜黄素糖苷化产物的方法，包括以下步骤:
[0039]步骤一，将菌株在无菌条件下接入培养基中(250mL三角瓶，装80mL液体培养基)，25°C下于180rpm摇床上避光培养；
[0040]步骤二，当菌丝生长旺盛时，按照每瓶2mg剂量，加入姜黄素底物；
[0041]步骤三，底物加入菌液中共培养6天后，减压抽滤除去菌丝，滤液以等体积乙酸乙酯萃取3次。有机相合并，减压浓缩至干；
[0042]步骤四，残渣经硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇(100: 1,50:1和10: 1,ν/ν)梯度洗脱，得到产物；
[0043]步骤五，对姜黄素转化动态进行考察。分别测定底物姜黄素和姜黄素糖苷化产物培养液中的浓度随培养时间变化的动态关系；
[0044]步骤六，对产物进行LC/MS分析。
[0045]实施例2
[0046]步骤一，将华根霉R.chinensis接种于250mL三角瓶中，每瓶盛80mL液体培养基，25°C下于180rpm摇床上避光培养24h，吸取其中5mL菌液置于100mL三角瓶中，每瓶盛380mL液体培养基，25°C下于180rpm摇床上避光培养；
[0047]步骤二，当菌丝生长旺盛时，按照每瓶1mg剂量，加