一种产表面活性剂微生物的高通量筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物育种，尤其是涉及一种产表面活性剂微生物的高通量筛选方 法。
【背景技术】
[0002] 目前可利用的生物表面活性剂非常有限，而要解决生物表面活性剂应用受到限制 的问题，需要筛选获得更多新型、高产的生物表面活性剂产生菌。在建立简便准确的菌株活 性评价方法的基础上从自然界筛选或对现有菌株进行遗传物质改造一直是获得优良菌种 的重要途径。
[0003] 由于大量的菌株需要定性，因此高效的筛选策略是分离得到所需微生物的关键， 为此，人们不断开发与完善各种筛选模型，对现有的筛选技术也在进行改进。目前，广泛应 用的是排油圈筛选法，通过观察发酵液能否在形成油层的水面上产生排油圈以及测定排油 圈的大小来衡量发酵液的表面活性，该方法适应性广泛，操作相对简单，经适当改进已成 功进行多种表面活性剂高产菌株的筛选，但是该方法本身存在很大局限性，需要人为进行 排油圈直径的测定，此过程不仅需消耗大量人力和时间，且易增大实验误差，不适用于样 品较多的初筛工作，无法满足高通量筛选及标准化检测的需求。另外，血平板筛选法、蓝 色凝胶平板法和原油平板法也是常用的表面活性剂产生菌筛选方法，这三种方法虽然具 有简便直观、工作量小的优势，但是却存在较严重的假阳性和假阴性问题，而且在适用范 围上具有自身难以克服的局限性，如血平板不能用于筛选利用石油烃才能产表面活性剂 的微生物（1.BanatI.M.Theisolationofathermophilicbiosurfactantproducing Bacillussp. [J].Biotechnologyletters, 1993, 15(6) : 591-594.)，蓝色凝胶平板法仅适 用于产糖脂及阴离子表面活性剂微生物的筛选（2.SiegmundI.，WagnerF.Newmethodfor detectingrhamnolipidsexcretedbyPseudomonasspeciesduringgrowthonmineral agar[J].BiotechnologyTechniques, 1991，5(4) :265_268.)，而原油平板法只适用于利用 烃的微生物（3. 丁立孝，何国庆，刘晔等.脂肽生物表面活性剂产生菌的筛选[J].农业 生物技术学报，2004, 12(3) :330-333.)。在各种表面活性剂产生菌筛选方法中最准确的是 表面张力测定法，该法虽然灵敏准确，但是操作繁琐，工作量大，而且需要专门仪器和足够 的未经稀释的样品，不适用于针对大量菌株的初筛工作。
[0004] 相比上述筛选方法，液滴崩塌法具有很大优势，不仅操作简单、现象直观，而且适 用范围广泛、灵敏°C和准确°C俱佳。同时，不需要昂贵的仪器，样品也仅需几yL。该法是 在一个有96微孔板盖上进行的，盖中每个微孔中都覆盖有一薄层油，然后加入发酵液，观 察油层是聚集或轻微分散或完全分散来判断生物表面活剂的量。1991年D.K.Jain率先 采用该法检测不同细菌发酵液的表面活性（4.JainD.K.，Collins-ThompsonD.L.，Lee H.,TrevorsJ.T.Adrop-collapsingtestforscreeningsurfactant-producing microorganisms[J].JournalofMicrobiologicalMethods, 1991, 13(4):271-279.), 1998年AdriaA.Bodour对油的种类和体积进行了优化，使该法具有更高的灵敏°0和准 石角。C(5.BodourA.A. ,Miller-MaierR.M.Applicationofamodifieddrop-collapse techniqueforsurfactantquantitationandscreeningofbiosurfactant-producing microorganisms[J].JournalofMicrobiologicalMethods, 1998, 32(3):273-280.)〇
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供工作量小、效率高而且成本低廉的一种产表面活性剂微生 物的高通量筛选方法。
[0006] 本发明包括以下步骤：
[0007] 1)清洁和烘干96孔板盖；
[0008] 2)用移液器向96孔板各孔中加入2yL10W-40Pennzoil?并放于恒温箱中静置 直至形成平整的油膜，备用；
[0009] 3)待测菌株接种于装有种子培养液的深孔板中孔活化及恒温震荡培养1~2天， 得种子发酵液；
[0010] 4)将种子发酵液转接于另一个盛有发酵培养液的深孔板中震荡培养，得发酵液；
[0011] 5)利用深孔板离心机离心发酵液，取发酵上清液作为后续检测样品；
[0012] 6)用移液器吸取发酵上清液至铺有平整油膜的96孔板盖对应孔中；观察发酵上 清液液滴是否扩散或崩塌，或者比较各孔液滴扩散或崩塌的速度，若在较短时间内即扩散 或崩塌，则将相应菌株记录为产表面活性剂阳性菌株，否则，即为不产表面活性剂菌株。
[0013] 在步骤1)中，所述清洁和烘干96孔板盖的方法可为：对于尚未铺油的96孔板盖， 先用洗洁精清洗2次；再依次用自来水、50~65°C热水、乙醇和蒸馏水各清洗3次，将96 孔板盖朝下晾干或吹干备用；对于已过铺油的96孔板盖，先用纸巾擦去部分发酵液和乳化 油；再用柴油清洗剩余的润滑油2次，再用洗洁精清洗96孔板内盖3次，再依次用自来水、 50~65°C热水、乙醇和蒸馏水清洗3次，将96孔板盖朝下晾干或吹干备用。
[0014] 在步骤2)中，所述移液器可采用多通道移液枪；所述多通道移液枪可选自6通道 移液枪、8通道移液枪、12通道移液枪、96通道移液枪等中的一种。
[0015] 在步骤3)中，所述种子培养液的配方可为：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠 5g/L，pH用1M的NaOH溶液调至7. 6 ;所述活化可将菌株在琼脂平板上划线活化；所述培养 的条件可取单菌落接种于各孔中盛有200yL种子发酵液的96孔深孔板中，28~32°C培养 16 ~24h。
[0016] 在步骤4)中，所述发酵培养液和配方可为：葡萄糖10g/L，谷氨酸0.6g/L，氯化 按2g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾5g/L，七水合硫酸镁0. 5g/L，氯化钠24g/L，pH用1M NaOH溶液调至7. 6 ;所述震荡培养的条件可于28~32°C，200rpm震荡培养4~7天。
[0017] 本发明以96孔板作为发酵容器，每孔装液200yL，节省培养液，成本大幅降低；本 发明以多通道移液枪（6通道，8通道或12通道移液器）进行接种取样稀释等操作，每次操 作可以相应完成6~12个样品的接种、取样或稀释，实现操作的批量化，提高了操作效率； 本发明高通量筛选方法每个样品只需要5yL左右，每板96个样品检测操作时间只需要约 5min，大大缩短了操作所需时间，提高了检测效率。本发明以微孔板为操作平台的微生物培 养及表面活性测定方法的建立，为菌种筛选过程中实现高通量奠定了基础。微孔板体系的 菌株筛选方法具有微量化、小型化和平行化的特点，因此采用高通量策略筛选高效矿化微 生物能同时处理大量样品，节省人力、物力及时间，大幅提高筛选效率。
[0018] 本发明在A.A.Bodour研宄的基础上，采用