一种利用pcr扩增后直接dna测序筛查肝豆状核变性致病基因突变位点的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种通过对聚合酶链式反应（PCR)产物直 接测序确定ATP7B基因突变位点的方法。 技术背景
[0002] 肝豆状核变性，又称Wilson病（Wilson，sDisease,WD)，是一种铜代谢障碍的常 染色体隐性遗传性疾病。国外流行病学调查资料显示，其患病率为1. 5-3. 0/10万，基因频 率为0. 3%-0. 7%，杂合子频率估计为1/100。该病在我国尚无大宗资料的流行病学报告，根 据相关报道，Wilson病居全部单基因遗传病的第二位。
[0003] 对Wilson病诊断常常通过血浆铜蓝蛋白，血铜、尿铜含量，K-F环等指标来判断， 但W)病人中仅有80%病人表现为血浆铜蓝蛋白偏低，30-40%的病人有K-F环出现，漏诊和 误诊时有发生，错过最佳治疗时期，对病人造成不同程度的不可逆损害。随着分子生物技术 的发展及疾病致病机理研宄的深入，已经发现ATP7B基因突变是导致Wilson病的根本原 因。因此通过基因检测，筛查ATP7B基因上是否存在致病突变，对于Wilson病的精确诊断 具有重要的意义，同时也为产前诊断、优生优育提供指导。
[0004]ATP7B基因（WND; 0MM#277900)位于13号染色体上，全长78826bp，包含21个外 显子和20个内含子序列，目前已发现500多个致病位点，突变类型包括错义突变、无义突 变、缺失和插入等。这些突变位点大多位于WD基因的所有外显子，也有分布在内含子剪切 区内和上游启动子序列。因此对所有外显子编码区域、内含子剪切区域及上游启动序列进 行测序分析，对于明确诊断具有重要的意义。
[0005] 由于全基因序列较长，全基因测序费用高，所需样本量大，准确率低，不被临床和 患者所接受。我们通过先PCR扩增出目的序列，对目标序列进行测序分析，大大降低了测序 成本，节省了检测时间，且该方法简单易行，准确率高，具有实际的临床应用价值，为临床确 诊提供依据。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题：为Wilson病提供一种成本较低、简便快捷、准确度高、 可操作性强的基因检测方法，降低因临床症状不明显而导致的漏诊与误诊的机率，同时可 辅助产前筛查，指导优生优育。
[0007] 本发明采用的技术方案： 一种利用PCR扩增后直接DNA测序方法筛查ATP7B基因突变的方法，该方法通过对外 周血基因组DNA中ATP7B基因目标区域进行扩增、测序和生物信息分析的方法，进而筛查出 导致肝豆状核变性疾病的基因突变位点。
[0008] 所述的方法主要包括以下步骤： (1)样本基因组DNA的提取 (2)引物设计 根据Genebank公布的人类ATP7B基因序列，设计23对引物，扩增ATP7B基因全部的21 个外显子、上游启动序列及部分内含子序列，所设计的23对引物序列如表1。
[0009] (3)PCR扩增将每对引物分别进行扩增，扩增体系如下：无菌水11W，0. 01ug/ml 的模板〇. 5W，10剛的正向引物0. 5W，10剛的反向引物0. 5W，1. 25U/25W的Pre-mix酶 12. 5m； (4) 凝胶电泳：扩增结束后取产物0. 5W进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳验证，然后在紫外 凝胶成像系统下进行观察并拍照； (5) 进行PCR产物纯化和测序、并对测序结果进行序列比对分析，判断是否存在致病突 变。
[0010]所述样本DNA的提取包括以下步骤： (1) 取全血50~100y1，加入至1. 5ml收集管中，用灭菌水补至200y1 ; (2) 加入180yl蛋白酶缓冲液、20yl蛋白酶K和10mg/ml的RNA抑制酶A10yl，充 分吸打混匀，于56 °C水浴10分钟，进行细胞裂解； (3) 向裂解液中加入200y1乙醇，充分吸打混匀； (4) 将吸附柱安置于收集管上，然后将步骤（3)中的溶液移至吸附柱中，8000rpm离心 2分钟，弃滤液； (5) 将500y1的冲洗液BufferWA加入至吸附柱中，8000rpm离心1分钟，弃滤液； (6) 将700y1的冲洗液BufferWB加入至吸附柱中，12000rpm离心1分钟，弃滤液； (7) 重复操作步骤（6)，将吸附柱安置于收集管上，12000rpm离心2分钟； (8) 将吸附柱安置于新的1. 5ml离心管上，在吸附柱膜中央加入50~200y1的灭菌 水或洗脱液，室温静置5分钟；8000rpm离心2分钟洗脱DNA，得到DNA样本； (9) DNA的定量：提取得到的基因组DNA，通过分光光度计测定其吸光度并计算纯度。
[0011] 所述的方法PCR扩增时条件如下：95°C预变性5分钟，95°C变性30秒，55°C退火 30秒，72 °C延伸60秒，按变性、退火、延伸的顺序进行35个循环后，再72 °C延伸5分钟，得 到扩增产物，于4°C保存。
[0012] 所述电泳验证时的电压为100v，电泳时间为45min。
[0013]所述的引物序列在筛查肝豆状核变性基因突变中的应用。
[0014] 本发明的积极有益效果： 1、本发明的筛查肝豆状核变性基因突变方法采用PCR扩增后直接DNA测序的方法，与 传统测序方法相比，该方法简便快捷，得到的PCR产物能直接进行DNA序列分析，能够明确 突变位点，为检测基因突变提供了最可靠的方法，并且该方法所设计的引物灵敏度高，在人 基因组浓度低至1pmol时，仍能扩增出目标条带，显著提高了检测的灵敏度与准确性。
[0015] 2、本发明设计的引物在合适条件下扩增出的条带单一，无非特异性条带，具有较 好的特异性，为PCR产物的纯化回收创造了有利条件，降低测序成本。（从图1中可以明显 看出所扩增的单一条带)。
[0016]3、本发明通过对ATP7B基因全外显子及启动序列先进行PCR扩增，再测序，这样 检测位点明确，针对性强，大大提高了测序结果的准确性，降低检测成本。
[0017] 4、本发明的PCR引物设计合理、高效，特异性强、灵敏性高，利用该引物通过检测 外周血提取DNA进行体外扩增，得到所需的PCR产物，待直接测序后确定所测目标基因的多 态性，为肝豆状核变性疾病的临床诊断及优生优育提供了诊断依据。
【附图说明】
[0018] 图1本发明的23对引物所对应的扩增条带。
[0019] 图2本发明用软件对每对引物的测序结果。
[0020] 图3本发明对检测位点进行的结果比对图。
【具体实施方式】
[0021] 例1: 一种利用直接测序法筛查肝豆状核变性基因突变的方法，包括以下步骤： 1、外周血取样 用含有乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(简称EDTA)的抗凝管抽取待查的