以金属离子螯合亲和色谱柱为固相载体的蛋白质复性方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域的蛋白质复性方法，具体涉及到一种以金属离子螯合亲 和色谱柱为固相载体的蛋白质复性方法。
【背景技术】
[0002] 成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactor,FGF)是一类具有广泛生物学 活性的肽类物质，含18个成员（FGF1-10和FGF16-23)。根据序列和结构的差异，FGF可以分 为五个旁分泌亚家族斤6?1、？6?3、？6?4、？6?8和？6?18亚家族)和一个内分泌亚家族斤6?19 亚家族)，分别参与组织和器官的发育、血管形成、创伤修复和内分泌调节等生理过程。上述 这些生物学功能凸显了FGF在临床医学领域广阔的应用前景和推广价值，使其成为生物制 药领域的研发热点。
[0003] 重组成纤维细胞生长因子（recombinantfibroblastgrowthfactor,rFGF)主 要通过以大肠杆菌为宿主菌的重组基因工程方法制备并规模化生产。然而，作为外源蛋白， rFGF在大肠杆菌中的大量表达，往往形成无活性蛋白聚集体，即包涵体，如FGF9、FGF19、 FGF20和FGF21等。rFGF包涵体须经过菌体破碎和分离、包涵体洗涤和变性以及蛋白复性 等步骤，才能制备尚纯度和尚活性的目标蛋白；其中，蛋白质的复性已成为制约rFGF制备 和规模化的关键因素之一。目前，rFGF包涵体的蛋白复性主要采用透析复性，即变性溶解 的rFGF置于透析袋内，通过逐渐降低外透液中变性剂的浓度来控制变性剂的去除速度，使 rFGF逐渐恢复其生物结构与活性。该方法操作简单，蛋白溶液体积不变，但有其局限性，如 耗时长、处理体积小、消耗缓冲液大、无法应用到规模化生产。
[0004] 色谱柱技术作为分离纯化蛋白质的手段已经发展的比较成熟，但将其利用于蛋白 质复性过程是近几年才发展起来的一项技术，也称之为色谱柱蛋白复性。该方法是将变性 溶解的包涵体蛋白吸附各类色谱柱上，然后用洗脱未被吸附的变性剂和杂蛋白质等，最后 用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱并实现复性。与传统的复性方法相比，其优点是：（1)提 供变性蛋白一个组成连续变化的、可供选择的折叠环境，并不断修正含有错误三维结构的 折叠中间体；（2)完全消除变性蛋白分子脱离变性剂环境后的分子聚集，避免沉淀的产生， 提高蛋白复性的质量和活性回收率；（3)蛋白复性的同时可使目标蛋白得到一定程度的纯 化。色谱柱固相蛋白复性主要采用离子交换色谱，其他色谱报道较少。将色谱柱固相蛋白 复性应用于rFGF的蛋白复性至今尚未报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于为了克服现有技术的不足而提供一种蛋白复性时间短、获得的 复性蛋白纯度高和活性高的蛋白质复性方法。
[0006] 为了达到上述目的，本发明公开了一种以金属离子螯合亲和色谱柱为载体的固 相蛋白复性工艺，其特征在于包括以下步骤：（1)将携带His或者SUM0标签且以包涵体 形式表达的重组成纤维细胞生长因子蛋白，即His-rFGF或SUMO-rFGF溶解于变性缓冲液 中，使之处于还原变性状态；2)将处于还原变性状态的上述蛋白吸附于金属离子螯合亲和 色谱柱；（3)用复性缓冲液，以0. 1毫升每分钟的流速将所述变性缓冲液置换；（4)用储 存缓冲液A冲洗色谱柱置换出其中的复性缓冲液，并用储存缓冲液B将复性His-rFGF或 SUMO-rFGF从色谱柱上洗脱下来。
[0007] 本发明利用携带His或SUM0 标签的rFGF(如His-FGF9、His-FGF15、SUM0-FGF15、 His-FGF19、SUM0-FGF19、His-FGF20、SUM0-FGF20、His-FGF21 和His-FGF23)与金属离子螯 合亲和色谱柱之间特异性亲和作用，将还原变性的His-rFGF或SUMO-rFGF吸附到金属离子 螯合亲和色谱柱上，然后通过逐渐改变流动相的组成将色谱柱中的变性缓冲液置换为复性 缓冲液，使得在完成目标蛋白纯化的同时，避免了复性蛋白折叠中间体相互聚集，获得高效 的蛋白复性。相比于传统的透析复性，采用该方法不仅大大缩短了蛋白复性的时间，还能够 使得变性His-rFGF或SUMO-rFGF在高浓度（l-10mg/mL)下获得高纯度和高活性的复性蛋 白，为一步实现高效蛋白复性和纯化提供新工艺。
[0008] 下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
【附图说明】
[0009] 图1为本发明中SUM0-FGF19的发酵表达中SDS-PAGE分析SUM0-FGF19的诱导 前、诱导后、菌体裂解上清和沉淀样品。其中M是标准蛋白分子量（由上至下170kD，130kD， 100kD，70kD，55kD，40kD，35kD，25kD，15kD，10kD) ;A/C/E为诱导前菌体；B/D/F为诱导后菌 体；G为菌体经破碎和离心后的上清液；H为菌体经破碎和离心后的沉淀。
[0010] 图2为本发明实施例2中SDS-PAGE分析SUM0-FGF19金属离子螯合亲和色谱柱固 相复性所得产物。其中M为标准蛋白分子量（由上至下116. 0kD，66. 2kD，45kD，35kD，25kD， 18. 4kD，14. 4kD);A为复性前变性SUM0-FGF19;B和C为复性SUM0-FGF19。
[0011] 图3为本发明实施例2中蛋白免疫印迹(Westernblotting)鉴定金属离子螯合 亲和色谱柱固相复性所得SUM0-FGF19。
[0012] 图4为本发明实施例2中Westernblotting检测固相复性所得SUM0-FGF19对 HepG2细胞内ERK1/2激酶磷酸化程度的影响。
[0013] 图5为本发明实施例2中聚合酶链式反应（PCR)法检测复性所得SUM0-FGF19对 小鼠肝脏胆固醇 7_ 轻化酶（cholesterol7-alphahydroxyl-lase，Cyp7al)mRNA水平的 影响。
【具体实施方式】
[0014] SUM0-FGF19 的发酵表达 将测序正确的SUM0-FGF19质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑单克隆菌落，37摄氏 度，200转每分钟震荡培养6小时。按照5%转接新鲜LB培养基，37摄氏度，200转每分钟 培养1. 5小时，37摄氏度加入1毫摩尔每升异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)，分别在诱导1、2、4 和8小时后取菌，离心收集菌体，SDS-PAGE分析蛋白表达情况，并保存菌种。选取高表达菌 株接种到氨苄（100毫克每升）LB培养基中，37摄氏度，160转每分钟震荡培养过夜。按照 5%转接新鲜LB培养基，37摄氏度，200转每分钟培养1. 5小时，取诱导前样品；37摄氏度加 入1毫摩尔每升IPTG，诱导4小时后，取诱导后样品，收集菌体。SDS-PAGE分析SUM0-FGF19 在IPTG诱导前后蛋白表达情况。
[0015] 将4克SUM0-FGF19菌体放入200毫升烧杯中，加入裂解液（25mMTris-HCl缓冲 液，pH=8.0，10%甘油，150mMNaCl)至100毫升，再加入200微升苯甲基磺酰氟（PMSF)，玻 璃杯搅拌使其成悬浮液。低温超声破碎菌体，10分钟每次，重复6次。4摄氏度，18000转 每分钟，离心90分钟，SDS-PAGE分析上清和沉淀，结果显示SUM0-FGF19存在于沉淀，说明 SUM0-FGF19以包涵体形式表达。
[0016] 实施例1镍离子金属螯合亲和色谱柱固相蛋白复性 (1) 将SUM0-FGF19包涵体经过裂解和离心后收集沉淀，S卩SUM0-FGF19 ; (2) 用变性缓冲液（25mM三(羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液（Tris-HCl)，pH=8. 0， 150mMNaCl，8M尿素，50mM0-疏基乙醇）混悬上述沉淀，并在室温下搅拌1小时。于4 摄氏度，18200转每分钟，离心30分钟，取上清液，考马斯亮蓝G250法检测蛋白浓度； (3) 用上述变性缓冲液对镍金属离子螯合亲和色谱柱进行预先平衡。将20毫升4mg/ mL的变性SUM0-FGF19溶液以1. 5毫升每分钟的流速加载于镍金属离子螯合亲和色谱柱； 待上样完成后，用变性缓冲液冲洗以去除未与柱子结合的蛋白，直至信号平衡；在8个小时