一种合成利西拉来的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成利西拉来的方法。
【背景技术】
[0002] 利西拉来（Lyxumia)于2013年在欧洲获得上市批准，该药物是一种胰高血糖素样 肽l(GLP-l)受体激动剂，属注射用糖尿病治疗药物，该药物一天注射一次，连同其它药物 或者胰岛素一块使用，适用于只能通过药物来控制血糖水平的患者。利西拉来肽序如下：
[0003] H-His1-Gly2-Glu 3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser 8-Asp9-Leu10-Ser11-Lys12-Gln 13-Met14-Glu15-Glu16-Glu 17-Ala18-Val19-Arg20-Leu 21-Phe22-Ile23-Glu24-Trp 25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly 29 -Gly30-Pro31-Ser32-Ser33-Gly 34-Ala35-Pro36-Pro37-Ser 38-Lys39-Lys40-Lys41-Lys 42-Lys43-Lys4 4-nh2
[0004] 由于本品的结构特点，在偶联过程中会产生一些特殊的杂质，如N端的His， 在偶联过程中会产生5-10 %左右的[Di-His1]-利西拉来，Gly在偶联过程中会产生 少量的[Di-Gly]-利西拉来，以及其他的具有毒性的杂质，如[Di-Ser 33]-利西拉来和 [Di-Ala35]-利西拉来，这些杂质的极性与利西拉来相近，很难用制备液相进行有效分离，最 好能从合成工艺上给予解决。
[0005] 中国专利CN103709243A公开了一种制备利西拉来的方法，其采用两个两片段合 成策略进行合成，一是1-2位氨基酸片段和3-44位氨基酸片段，二是1-4位氨基酸片段和 5- 44位氨基酸片段，该专利以上述合成方法着重解决[Di-His1]-利西拉来和[Di-Gly2]-利 西拉来杂质问题，但是并未记载两种杂质的具体含量，只是提及粗肽收率和精肽纯化收率 得到大幅提高。此外，该专利记载的利西拉来总收率较低，仅为29%。
[0006] 中国专利CN104211801A同样公开了一种制备利西拉来的方法，其在合成32-35位 氨基酸时，直接采用经过液相合成的整个片段，其余氨基酸进行逐一的固相合成，该专利以 上述合成方法着重解决[Di-Ser 33]-利西拉来和[Di-Ala35]-利西拉来杂质问题，并记载可 控制在0. 1 %以内，同时该专利和CN103709243A进行了对比，证明CN103709243A方法制备 的利西拉来中[Di-Ser 33]-利西拉来和[Di-Ala35]-利西拉来分别为0. 23%和0. 35%，总收 率为29 %，相比其0. 1 %以内的杂质含量以及41 %的总收率的技术效果难以适合于工业化 生产。
[0007] 虽然专利CN104211801A的方法在控制[Di-Ser33]-利西拉来和[Di-Ala 35] -利西 拉来时具有优势，同时在总收率方面也表现出较高水平，但是不断追求高质量产品是一个 行业技术发展的要求，如何更进一步的提高产品在上述几个方面的品质，需要对合成方法 进行不断的研宄和改进。多肽药物的合成中，合成策略是影响产品品质的主要因素，如何在 保证纯度和收率的前提下，尽可能的降低合成工艺的复杂程度、杂质以及缩短合成周期，是 当下技术人员的研宄重点。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成利西拉来的方法，使得本发明所述方 法能够控制[Di-His 1]-利西拉来含量不超过0. 12%，同时避免产生[Di-Gly]-利西拉来、 [Di-Ser33]-利西拉来和[Di-Ala 35]-利西拉来杂质，整体提高利西拉来产品的品质。
[0009] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0010] 一种合成利西拉来的方法，包括以下步骤：
[0011] 步骤1、合成在SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列N端、His侧链上偶联有保护基的多 肽片段1 ;
[0012] 合成在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列N端、Glu侧链上偶联有保护基的多肽片段 2 ；
[0013] 合成在SEQ ID N0:3所示氨基酸序列N端偶联有保护基的多肽片段3 ;
[0014] 合成在SEQ ID N0:4所示氨基酸序列N端、Ser侧链上偶联有保护基的多肽片段 4 ；
[0015] 合成在SEQ ID N0:5所示氨基酸序列N端偶联有保护基的多肽片段5 ;
[0016] 步骤2、将N端、Lys侧链上偶联有保护基的保护Lys，在缩合试剂和活化试剂作用 下和氨基树脂偶联，形成肽树脂1，从肽树脂1的N端出发，按照SEQ ID N0:6所示氨基酸序 列C端到N端的顺序，在缩合试剂和活化试剂作用下，逐一偶联保护氨基酸，形成肽树脂2;
[0017] 步骤3、在缩合试剂和活化试剂作用下，将多肽片段5的C端和肽树脂2的N端偶 联形成肽树脂3,然后将多肽片段4的C端和肽树脂3的N端偶联形成肽树脂4;
[0018] 步骤4、在缩合试剂和活化试剂作用下，将N端偶联有保护基的保护Pro的C端和 肽树脂4的N端偶联形成肽树脂5,然后将多肽片段3的C端和肽树脂5的N端偶联形成肽 树脂6;
[0019] 步骤5、在缩合试剂和活化试剂作用下，从肽树脂6的N端出发，按照SEQ ID N0:7 所示氨基酸序列C端到N端的顺序，逐一偶联保护氨基酸，形成肽树脂7;
[0020] 步骤6、在缩合试剂和活化试剂作用下，将多肽片段2的C端和肽树脂7的N端偶 联形成肽树脂8,然后多肽片段1的C端和肽树脂8的N端偶联形成利西拉来树脂；
[0021] 步骤7、利西拉来树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到利西拉来粗品，粗品纯 化转醋酸盐，获得替度鲁肽成品。
[0022] 利西拉来主链氨基酸多达44个，采用片段方法进行合成存在很多种形式，但只有 合适的片段方法才能保证较高的利西拉来的总收率以及纯度，同时又能降低杂质的产生。 为此，申请人根据长期的试验研宄，提出了本发明所述方法来制备利西拉来，在保证纯度的 前提下，进一步提高总收率以及降低合成方法的杂质的产生。
[0023] 在本发明合成方法中，本发明先分别合成利西拉来1-2位氨基酸片段（即多肽片 段1)、3_4位氨基酸片段（即多肽片段2)、29-30位氨基酸片段（即多肽片段3)、32-33位 氨基酸片段（即多肽片段4)、34-35位氨基酸片段（即多肽片段5)，而后采用片段和逐一合 成（剩余保护氨基酸均采用逐一合成）两种方式，按照利西拉来主链C端到N端的肽序进 行合成，以利西拉来主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式：
[0024] H-His1-Gly2-Glu 3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser 8-Asp9-Leu10-Ser11-Lys12-Gln 13-Met14-Glu15-Glu16-Glu 17-Ala18-Val19-Arg20-Leu 21-Phe22-Ile23-Glu24-Trp 25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly 29 -Gly30-Pro31-Ser32-Ser33-Gly 34-Ala35-Pro36-Pro37-Ser 38-Lys39-Lys40-Lys41-Lys 42-Lys43-Lys4 4-NH2
[0025] 3￡0 1〇勵：1-5所示氨基酸序列即为上式中编号1-2、3-4、29-30、32-33、34-35的 多肽序列，SEQ ID N0:6所示氨基酸序列即为上式中编号36-43的多肽序列，SEQ ID N0:7 所示氨基酸序列即为上式中编号5-28的多肽序列。
[0026] 其中，利西拉来C端的氨基为采用酸解液从氨基树脂上裂解下来的氨基，其并不 属于氨基酸上的氨基。
[0027] 作为优选，所述多肽片段1-多肽片段5均通过固相合成法或液相合成法合成。
[0028] 作为优选，所述多肽片段1为Fmoc/Boc-His (Trt) -Gly-〇H，多肽片段2为 Fmoc_Glu(OtBu)-Gly-〇H，多肽片段 3 为 Fmoc_Ser(tBu)-Ser(tBu)-〇H，多肽片段 4 为 Fmoc_Gly_Ala_0H，多狀片段 5