一种增强脂肪间充质干细胞免疫学性能和迁移能力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞治疗技术领域脂肪间充质干细胞技术领域，特别涉及一种增强脂 肪间充质干细胞免疫调节功能和迀移能力的方法。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs)作为一类成人干细胞，凭借其独 特的生物学特性，在免疫治疗和再生医学领域得到了广泛的研宄。这种成纤维样细胞于 1968年首次被发现，并在随后的研宄中证实，MSCs能够从多种组织中分离得到，并且能够 在体外培养扩增。
[0003] MSCs目前被广泛应用于组织工程、损伤修复以及自身免疫性疾病等领域，这源于 MSCs所具备的以下特性：
[0004] 1)能够在体内向组织损伤部位进行迀移；
[0005] 2)具有多向分化潜能；
[0006] 3)能够分泌多种生物活性因子，参与损伤修复和炎症抑制；
[0007]4)具备免疫耐受性和免疫调节功能。
[0008] 对MSCs发挥组织修复、免疫抑制功能的分子机制的研宄，有助于进一步推进MSCs 在细胞治疗工程领域的应用。
[0009] MSCs具有向受损伤组织迀移的能力，也被称作归巢能力，通过迀移到特定的受损 区域进而发挥修复功能。目前普遍认为MSCs是通过各种趋化因子、黏附分子及其受体之间 的相互作用，从而对损伤或炎症组织作出回应，激活、迀移到损伤组织中，发挥修复功能。有 研宄证实，患有肿瘤或急性炎症的动物模型中，损伤部位会合成释放多种趋化因子，包括血 管内皮生长因子、干细胞生长因子、SDF-1等，而表达相应受体的MSCs就会对此作出回应， 向受损部位迀移。
[0010] MSCs主要的免疫学特性是低免疫原性和免疫抑制能力：不表达共刺激分子，低水 平表达主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex, MHC) I类分子，非组 成型表达MHC II 类分子[Sharma R R，et al. Transfusion, 2014, 54 (5): 1418-1437.]。Kong 等研宄表明MSCs能够影响各类T细胞亚群免疫性能，将MSCs与被激活的T细胞在体外共 培养能导致促炎因子分泌量降低，包括干扰素（Interferon, IFN) y、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF) a、IL_6等，同时增加抗炎因子IL-4和IL-10的分泌水平，表明MSCs 能够平衡 Thl 和 Th2 的分泌活动[Kong Q, et al. J NEUR0IMMUN0L, 2009, 207(1) : 83-91.]。 此外，MSCs还能够介导对B细胞增殖的影响，并抑制树突状细胞的分化、成熟。多种细胞分 子参与了 MSCs的免疫调节行为，包括肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor, HGF)、 前列腺素（Prostaglandin, PG)E2、转化生长因子（Transforming growth factor, TGF)0、 11-10、11^-6、吲噪胺2,3-过氧化酶（1]1(1〇163111；[116-2,3-(1;[(?5^6仙86，100)以及组织相容 性白细胞抗原（Histocompatibility leukocyte antigen, HLA)G5 等[Gesundheit B，et al. MED HYPOTHESES, 2014.]。
[0011] 由于MSCs能够向损伤部位迀移，并具有强大的抗炎、免疫调节能力，使其在组织修 复和自身免疫性疾病治疗等方面具有全新的思路和无限的潜能。自身免疫性疾病是由于宿 主对自体抗原的免疫耐受缺失，伴随着一系列对自体特定的靶细胞和多器官系统的攻击， 从而导致的一类慢性疾病[Anaya J M. Autoimmunity reviews, 2012, 11 (11) : 781-784. ] 〇 包括1型糖尿病、类风湿性关节炎、炎症性肠病、移植宿主反应，以及系统性红斑狼疮等。自 身免疫性疾病的传统治疗方案多以糖皮质激素和免疫抑制剂为主，虽能有效抑制异常的自 身免疫，但是长期使用会引发患者的耐受性以及诸多不良反应。于文龙等将脐带间充质干 细胞通过尾静脉注射入1型糖尿病小鼠，3个月后检测各组小鼠的血糖、每日胰岛素使用 剂量、CD4+T细胞数量以及胰岛a和0细胞的数量和体积。结果发现脐带间充质干细胞 干预组胰岛a、0细胞结构更完整，数量明显上升；⑶4+T细胞数量、胰岛素用量和血糖水 平明显降低[于文龙，徐薇，于江苏.中国组织工程研宄，2013, 17 (19) =3474-3480.]。 Ma等进行的体内实验显示，MRL/lpr狼疮鼠的存活时间可通过移植MSCs发生明显改善， 并且体内活化B细胞、衆细胞数量均出现明显下降[Ma X，et al. Cell transplantati on, 2013, 22(12) :2279-2290. ]。Zheng等研宄表明，MSCs能够显著抑制RA患者T细胞的 增殖及激活抗原的表达，并且这种抑制呈剂量依赖性，而且MSCs可以抑制⑶4+T细胞与 CD8+T 细胞分泌 IFN-y 和 TNF-a，同时上调 IL-10 的水平[Zheng Z H, et al. Rheumatolo gy, 2008, 47(1) : 22-30. ] 〇
[0012] 脂肪间充质干细胞（Adipose-derived stem cells, ASCs)作为一类来源于脂肪组 织的间充质干细胞，相较于其他来来源的间充质干细胞，在实验研宄和临床应用中具备更 多的优势：脂肪组织的取材方便、安全，通过简单的麻醉吸脂术或者皮下脂肪组织的剪切即 可获得，对供体带来的疼痛和伤害更小；ASCs在脂肪组织中的含量更丰富，通过酶消化法 等技术即可分离出大量的原代细胞，并且不存在伦理问题。此外，ASCs具备间充质干细胞 共有的生物学特性，包括向骨细胞、脂肪细胞等分化的潜能，在体内向炎症部位的趋向性， 更重要的是具备免疫调节能力。因此，ASCs将在组织工程、免疫性疾病治疗等领域有着重 要的临床研宄意义。而ASCs功能性的表达TLRs，表示被激活的TLRs可能通过启动信号通 路级联反应，最终调控ASCs的免疫因子的分泌，改变其免疫学性能。
【发明内容】
[0013] 本发明为了提升间充质干细胞在免疫性疾病中的应用效果，增强其在体内向损伤 /炎症部位的迀移能力和发挥免疫调节功能，提出了一种通过激活功能性的表达于脂肪间 充质干细胞表面的受体蛋白，上调脂肪间充质干细胞的免疫调节功能和迀移能力。
[0014] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
[0015] -种增强脂肪间充质干细胞免疫学性能和迀移能力的方法，步骤如下：将分离提 取的脂肪间充质干细胞原代培养至80%融合，再进行传代培养，选用生长良好的第三代细 胞，用含有TLR3激活剂Poly(I: C)的细胞培养液进行共培养，最后进行实验组和对照组的 Real-timePCR和趋化性实验对比检测；
[0016] (1)脂肪间充质干细胞的分离及原代培养
[0017] 从小鼠腹股沟部剪取脂肪组织，用HBSS缓冲液冲洗，充分剪碎，加入0. 1 % I型胶 原酶进行消化，然后过滤并离心l〇min得到的细胞生长培养液；对细胞生长培养液进行重 悬沉淀得到细胞悬液，将细胞悬液接种到培养瓶中，置于5% C02细胞培养箱中进行原代培 养；
[0018] (2)脂肪间充质干细胞的传代培养
[0019] 待步骤（1)原代培养至80%融合，用含0.25§/10011^￡0了4的胰蛋白酶液进行消 化，重悬细胞，然后接种到培养皿中传代培养；待细胞培养至80%融合后，进行传下一代培 养，得到第三代脂肪间充质干细胞；
[0020] (3) POLY (I:C)对脂肪间充质干细胞的刺激
[0021] 用含有TLR3激活剂Poly (I:C)的细胞生长培养液培养步骤⑵培养lh，得到的 第三代脂肪间充质干细胞，然后用含〇. 25g/100mL EDTA的胰蛋白酶液进行消化，重悬细胞； 所述的含有TLR3激活剂Poly (I:C)的细胞生长培养液中Poly (I:C)的含量为lyg/mL; 细胞生长培养液中含有L-谷氨酸钠2mM、三抗的体积百分数1 %、胎牛血清的体积百分数 10%;含有TLR3激活剂P〇ly(I:C)的细胞生长培养液为DMEM/F121:1培养基；
[0022] (4) Real-time PCR检测细胞因子和趋化因子的表达
[0023] 利用Real-time PCR方法分别对经过Poly(I:C)共培养后的脂肪间充质干细胞和 未经？〇17(1:〇刺激的脂肪间充质干细胞进行对比实验，对二者11^6、16?-|3、10 3-1、1((：、 Eotaxin-1、VEGF细胞因子或趋化因子mRAN表达水平进行检测；
[0024] (5)体外趋化性试验
[0025] 利用transwell小室进行细胞侵袭试验，分别取生长至80 %融合的经过 Poly(I:C)共培养后的