抗大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体及其应用
【专利说明】抗大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体及其应用
[0001] 发明所属领域
[0002] 本发明涉及杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体技术领域，具体说，本发明涉及针 对大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体及其应用。
【背景技术】：
[0003]大鲵（Andrias davidianus)属于有尾目（Caudata)隐鲍鲵科 (Cryptobranchidae)大鲵属（Andrias)，为国家二级野生保护动物，已被列入CITES公约附 录I中。由于大鲵具有极高的经济价值和科学意义，为科学保护和合理利用这一珍稀物种 资源，自1978年报道首例大鲵人工繁育成功以来，我国许多有大鲵自然分布的地区都积极 开展了大鲵的人工繁育和养殖。目前大鲵已经成为一种珍贵的水产养殖品种，在全国20多 个省市都有养殖。随着大鲵养殖业规模的不断增加和集约化程度的提高，疾病成为制约大 鲵养殖业持续发展的瓶颈。
[0004] 自2010年首次报道在陕西省发现大鲵病毒性疾病以来，随着大鲵苗种的交流和 贸易的兴盛，全国有越来越多的大鲵养殖场都暴发了该种病毒性疾病。病原学研宄发现，此 病的病原为病毒，属于虹彩病毒科（Iridoviridae)娃病毒属（Ranavirus)，即大鲵虹彩病 毒（Chinese giant salamander iridovirus，CGSIV)，由其感染大鲵而患病，称之为大鲵虹 彩病毒病（Chinese giant salamander iridovirus disease, CGSIVD)。感染 CGSIV 的大 鲵表现的病理特征主要有全身性的出血和局部溃疡两种。其中全身性的出血特征较为明 显；以溃疡为主的病症主要表现为：患病大鲵发病初期头部和四肢后肢肿大，随病情发展， 吻部、背部以及后肢出现溃疡，并伴有出血点，到后期，后肢部位的溃疡发展到肌肉几乎全 部烂掉以至于露出骨头。该病传染性强且发病死亡率高，往往可高达90 %以上，给许多大鲵 养殖户造成了巨大的经济损失。
[0005] 该病毒性疾病的发病时期不定，一年四季均可发病，但一般夏季的发病频率更高。 因为夏季气温高，而大鲵属于变温动物，温度过高对其生长发育不利，而且此时水中细菌繁 殖旺盛，为疾病的爆发创造了一定的条件。CGSIV感染对象选择性不强，从幼鲵到种鲵均可 感染。大鲵虹彩病毒病传播的方式表现为水平传播或兼有垂直传播。水平传播主要通过病 鲵的代谢活动将病毒由粪便、尿液等释放到体外，再通过水体、养殖用具以及人体等途径将 病毒传染给其他健康大鲵。
[0006] 目前，尚无有效的药物治疗该疾病。较为有效的防控措施主要还是通过及早发现、 及时采取隔离、消毒等预防方法来减少疾病进一步蔓延带来的损失。为了及时掌握我国养 殖大鲵虹彩病毒病的潜伏感染和发病状况，强化大鲵虹彩病毒病早期监测和预警，科学指 导防控，急需建立CGSIV的高通量快速检测方法。目前已有的CGSIV的检测方法有病毒分离 和核酸检测。其中病毒分离是CGSIV的金标准，但该方法费时且对于实验室的条件要求较 高。核酸检测方法有常规PCR检测方法、巢式PCR检测方法和已授权的专利检测方法-LAMP 检测方法，该类检测方法比传统的病毒分离方法更灵敏、快速，但分子诊断操作尤其是样品 的前处理相对繁琐，对操作人员的技术水平要求较高，而且较易发生污染导致假阳性结果， 尤其是LAMP检测方法，其检测结果更容易出现假阳性和假阴性结果，导致其在实际生产中 应用效果十分有限。
[0007] 发明技术内容：
[0008] 本发明的一个目的是提供特异性的针对大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体，使 用该抗体可快速地检测大鲵虹彩病毒的存在，方便快速，且成本低廉。
[0009] 本发明的另一个目的是提供可分泌抗大鲵虹彩病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞 株。
[0010] 本发明的再一个目的是提供大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体及分泌抗体的 杂交瘤细胞株的应用。
[0011] 本发明的再一个目的是提供检测大鲵虹彩病毒的试剂盒及其应用。
[0012] 本发明公开了一株分泌抗大鲵虹彩病毒衣壳蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 MCP26,它保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC C201533,保藏日期是2015 年4月29日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮 编430072,电话：027-68752319, Email:cctcc@whu. edu. cn。本发明公开后，细胞株处于公 开状态，第三方可依法从保藏机构索取，并再现本发明。
[0013] 本发明还公开了由杂交瘤细胞株MCP26分泌的单克隆抗体。本发明公开的单克隆 抗体，可以特异性的识别大鲵虹彩病毒衣壳蛋白亚基和大鲵虹彩病毒，抗体亚类及亚型为 IgG2b，k链。单克隆抗体腹水的间接ELISA效价达1(T6以上。
[0014] 本发明还公开了单克隆抗体在实验室条件下检测大鲵虹彩病毒衣壳蛋白和大鲵 虹彩病毒的的应用。
[0015] 本发明还公开了检测大鲵虹彩病毒衣壳蛋白和大鲵虹彩病毒的试剂盒，试剂盒中 包括单克隆抗体。
[0016] 优选的，本发明试剂盒还包括兔抗CGSIV多抗，并用其包被酶标板；杂交瘤细胞 株MCP26分泌的单克隆抗体为二抗；采用针对单克隆抗体的酶标抗体为三抗；封闭液；洗涤 液；显色液；终止液；抗体稀释液；阳性对照；阴性对照；试剂盒说明书。所述的兔抗CGSIV 多抗为纯化的CGSIV免疫兔子获得；所述的针对单克隆抗体的酶标抗体为HRP-羊抗鼠 IgG;所述的阴性对照为健康大鲵肝肾组织提取液；所述的阳性对照为感染CGSIV的大鲵肝 肾组织提取液。所述方法主要包括如下步骤：
[0017] ①兔抗CGSIV多抗包被酶标板，4°C过夜；
[0018] ②封闭酶标板；
[0019] ③加入待测样本，37°C孵育1小时，洗涤，晾干；
[0020] ④加入所述单克隆抗体，37°C孵育1小时，洗涤，晾干；
[0021] ⑤加入针对单克隆抗体的酶标抗体，37°C孵育1小时，洗涤，晾干；
[0022] ⑥加入显色液，显色lOmin ;
[0023] ⑦加入终止液，空白孔调零后读取吸光度值0D45tol(A值）。
[0024] 所述结果的判定标准为：阳性对照A值彡0. 5,阴性对照A值< 0. 1，实验成立。样 品A值/阴性对照A值平均值彡2. 1，判为阳性，否则为阴性。
[0025] 优选的，所述兔抗CGSIV的最佳稀释倍数为1:500,所述的单抗MCP26的最佳稀释 倍数为1:5000,所述的针对本发明单抗的HRP-羊抗鼠IgG的最佳稀释倍数为1:500。
[0026] 本发明还公开了杂交瘤细胞株在检测大鲵虹彩病毒试剂盒中的应用。
[0027] 本发明还公开单克隆抗体在检测大鲵虹彩病毒试剂盒中的应用。
[0028] 在本发明中CGSIV指大銳虹彩病毒（Chinese giant salamander iridovirus，CGSIV)，由其感染大鲵而患病，称之为大鲵虹彩病毒病（Chinese giant salamander iridovirus disease, CGSIVD)，SVCV 指趣春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus, SVCV)，GCRV 指草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus, GCRV)、IPNV 指虹 蹲传染性膜腺坏死病病毒（Infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)、IHNV 指传染 性造血器官坏死病病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)、KHV 指锦鲤 疱瘆病毒（Koi herpes virus，KHV)。这些均为本实验室保存，病毒样本在本发明中仅作为 阳性或阴性对照。第三者需要可向本实验室索取，在本发明中，也可用其它实验室保藏的此 类病毒，如在中国科学院水生生物研宄所，中国典型培养物保藏中心，美国典型培养物保藏 中心就保藏相似的病毒，研宄者也可通过正常方式从研宄机构或保藏机构获取。本发明中 SP2/0, EPC细胞是普通细胞，在保藏机构都有销售。
[0029]本发明的优点：
[0030] 利用本发明所制备的单克隆抗体检测大鲵虹彩病毒，不需要昂贵的电子显微镜、 PCR仪等设备，成本较为低廉；所述的单克隆抗体MCP26腹水间接ELISA效价达1(T 6以上。 利用本发明所制备的单克隆抗体建立的大鲵虹彩病毒TAS-ELISA检测方法，当确诊感染虹 彩病毒的大鲵肝肾组织提取液稀释1024倍；或纯化的大鲵虹彩病毒稀释4096倍时，仍能 检测到病毒。特异性分析结果表明，所述的单抗MCP26对CGSIV有特异性反应，而与GCRV、 SVCV、IPNV、KHV等其他病毒均无特异性反应。因此，利用本发明所制备的单克隆抗体建立 的大鲵虹彩病毒TAS-ELISA检测方法，具有特异性好、灵敏度高等优点，可实现快速、高通 量地进行大鲵感染CGSIV的筛查，在大鲵虹彩病毒的检测和及时有效地防控CGSIV方面具 有良好的应用前景。
【附图说明】
[0031] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0032] 图1是大鲵虹彩病毒MCP蛋白诱导和纯化SDS-PAGE图，图中BI表示诱导前；M表 示低分子量蛋白Marker ;AI表示诱导后；S表示上清；P表示沉淀；FT表示穿透液；E1~E6 表示洗脱。
[0033] 图2是纯化重组MCP蛋白SDS-PAGE图，图中1，2表示纯化的重组MCP蛋白样品； M表示低分子量蛋白Marker.
[0034] 图3是单抗MCP26与CGSIV感染EPC细胞发生特异性反应的免疫荧光图。图中A 表示阳性，B表示阴性。
[0035] 图4是灭活CGSIV和重组MCP蛋白Western-blot图，图中M表不Marker ;1表不 重组MCP蛋白；2表示灭活CGSIV ;3表示阴性对照。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明 本发明，而不能限制本发明的保护范围。
[0037] 下述实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物 学实验指南》(F.M.奥斯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙等译.北京： 科学出版社，2004)中所述的方法进行。
[0038] 实施例1杂交瘤细胞株的获得及其单克隆抗体的制备
[0039] 1.材料和方法
[0040] 1. 1病毒、细胞与试验动物
[0041] 大鲵虹彩病毒略阳株（CGSIV-LY2011)由本实验室分离并保存，鲤鱼上皮瘤（EPC) 细胞和SP2/0细胞为本实验室提供；清洁级BALB/c雌性小鼠购自上海斯莱克实验动物有限 责任公司。PET21-MCP原核表达质粒为本实验室构建并保存。鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus, SVCV)、草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus，GCRV)、虹蹲传 染性膜腺坏死病病毒（