一种苦马豆素降解酶的编码基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术及酶基因工程领域，涉及一种能够降解疯草毒素一苦马豆素(Swainsonine，简写SW)的降解酶编码基因及其应用。
【背景技术】
[0002]疯草(Locoweed)是豆科棘豆属(Oxytropis)和黄苗属i Astragalus)有毒植物的统称，是世界范围内危害草原畜牧业生产可持续发展最严重的毒草。在我国，疯草主要分部于新疆、西藏、青海、甘肃、宁夏、陕西、内蒙古、山西和四川等西部地区。牛、马、绵羊、山羊、羚羊、骆驼、马鹿、驴、骡、猪等动物采食疯草后均可引起中毒。动物采食疯草后可以引起不同程度的中毒症状，临床表现以神经系统紊乱为特征，严重者导致动物死亡。
[0003]研宄发现，疯草的主要毒性成分是吲哚里西丁生物碱一苦马豆素(swainsomine，SW)，分子式SC8H15NO3，分子量173。熔点144 °C?145 °C，酸离解常数pKa为7.4，易溶于水及多种有机溶剂。SW发挥毒性作用主要是通过抑制细胞内主导糖蛋白代谢的关键酶一α-甘露糖苷酶。动物采食疯草后，SW在体内蓄积，竞争性抑制溶酶体α-甘露糖苷酶及高尔基体甘露糖苷酶II。从而糖蛋白加工发生障碍，蛋白合成受阻，低聚糖在动物组织细胞内大量蓄积，使不同组织细胞发生空泡变性。
[0004]疯草具有抗逆性强，返青早，枯萎迟，对动物的适口性好，蛋白含量高等特点。如将疯草加以利用，将会为我国西部草场可持续发展及畜牧业的生产带来巨大的经济效益。疯草中毒病的治疗目前仍无特效疗法，仅有的最有效的防除办法就是避免动物与疯草直接接触，但是这种防除办法也不是长久之计。如何高效、低成本，且不会给环境带来危害的去除疯草毒性成分一SW颇具研宄意义。
【发明内容】
[0005]针对上述现有技术存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种苦马豆素降解酶的编码基因(基因AAur_2040)，该基因具有降解疯草毒素一苦马豆素的作用。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种苦马豆素降解酶的编码基因(基因AAur_2040)，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所不O
[0007]一种所述的编码基因的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。
[0008]一种扩增所述的编码基因的引物，其核苷酸序列分别为SEQ ID N0.3和SEQ ID
N0.4。
[0009]含有本发明所述基因的重组质粒pET32a(+)_AAur_2040。
[0010]含有本发明所述基因的重组菌E.coil BL21 (DE3)/pET32a (+) - AAur_2040。
[0011]本发明能够为苦马豆素的降解提供有效的生物技术手段，对于降解苦马豆素解决动物疯草中毒病具有重要意义。
【附图说明】
[0012]图1 是 Arthrobacter sp.HW 08 总 DNA (Genomic DNA)电泳检测图；
图2是重新构建的表达菌EcoR\和Hand III双酶切核酸电泳图；
图3是重组菌诱导表达SDS-PAGE电泳图；
图4和图5是重组菌检测降解苦马豆素的气相色谱图。
【具体实施方式】
[0013]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
[0014]本发明从节杆菌属(AriAroAacier sp.)的菌株HW 08中克隆得到负责苦马豆素代谢的基因片段一AAur_2040。该节杆菌属(AriAroAacier sp.)的菌株HW 08，于2009年9月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No:N0.3313。保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研宄所，该菌的分类命名为节杆菌Arthrobacter sp.，并于2009年11月16日申请了中国发明专利，2011年12月14日授权，专利号为200910218983.5。
[0015]实施例1 Arthrobacter sp.HW 08 总 DNA (Genomic DNA)的提取。
[0016]1.1 Arthrobacter sp.HW 08 的扩大培养
在无菌操作环境下，将-70°C保存的AriAroAacier sp.HW 08用接种针挑取一针至Luria-Bertani (LB)固体培养基上划线，30°C，培养48 h。挑取单菌落，转接至LB培养液中200 r/min、30°C富集培养16 h。再以10%体积转接入含5% SW的无机盐培养液中200 r/min、30°C诱导培养24 h，取上清500 μ L进行薄层色谱检测SW含量(验证HW08菌能否降解SDo这里所述的LB固体/液体培养基等均为微生物研宄常见术语、培养基、技术和方法，具体参见《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，等著.)。下文中如无特别备注或说明均为微生物研宄常用技术、方法、培养基、试剂和药品，且均为《分子克隆实验指南》中有所记录。
[0017]1.2 Arthrobacter sp.HW 08 总 DNA 的提取
取1.1中能够降解SW的HW 08单菌落，接至100 mL的LB液体培养基培养16 h。离心收集菌体，按细菌DNA提取试剂盒(TIANGEN)中说明严格操作。
[0018]将提取到的菌体总DNA吸取2 μ L，经1% (m/v)琼脂糖电泳检测，发现所提取的总DNA基本上没有RNA存在，纯度较好，浓度较高(图1)。
[0019]实施例2 Sff降解酶编码基因AAur_2040的获得
经过Label Free蛋白质组学分析获得的差异蛋白，选取部分差异蛋白基因进行分析实验，结果筛选出一个能够降解SW的基因。
[0020]基因AAur_2040的引物序列为:
F5’ - CCGGAATTCATGCCTACCGCTAATGCTT-3’
(下划线为EcoR I酶切位点，基因序列为SEQ ID N0.3)；
R5， - CCCAAGCTTCTAGCCGATAGTGGAGACGT-3，
(下划线为Hind III酶切位点，基因序列为SEQ ID N0.4)
50 yL扩增体系:10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus)5 yL ；dNTP Mixture (2.5mM) 8yL ;引物(20μΜ)各 2 μ L ;实施例1 中所得总 DNA 2 4 1^;1^丁&9酶0.5 yL ；ddH20 30.5ULo 反应参数:94°C 预变性 3 min，94°C 变性 30 sec，49.5 °C 退火 30 sec，72°C 延伸 I min，扩增35个循环，最后再72°C延伸10 min终止反应。
[0021]扩增产物经I %琼脂糖电泳检测，发现扩增片段与预期大小一致(1000 bp左右)。切取含有AAur_2040基因扩增的