一种含丙型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学技术领域，具体是涉及一种含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法。
【背景技术】
[0002]丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染引起的主要经血液传播的疾病，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞肝癌(HCC)，目前尚无有效疫苗，亦无有效治愈方法，故早期、准确诊断HCV感染状况有重要意义。
[0003]HCV是一组致人类肝炎的病毒，其基因组呈现高度异质性，根据HCV基因组核苷酸序列的差异程度，可将HCV分为6种主要基因型及不同个亚型。照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示HCV基因型.以小写的英文字母表示其基因亚型(如la、2b、3c等)。HCV I?3型有广泛的分布，其中Ia和Ib型最为常见，约占全球丙肝感染的60.0 %，尤其是在北欧、北美、南欧、东欧和日本，3型主要在东南亚流行；4型在中东、埃及和中非较多；5型仅在南非被监测到，其他基因型在亚洲有不同的分布[http://www.wh0.1nt/csr/disease/hepatitis/whocdscsrlyo2003/en/index2.html#HCV;OliverGP，Eleanor B，Rachel T，et al.Genetic history of hepatitis C virus in East Asia.J Virol，2009，83:1071-1082.]。在中国，HCV Ib和2a型较为常见，其中以Ib型为主，多为IL28B基因CC型；某些地区也有la、2b和3b型报道。6型主要见于香港、澳门和部分南方边境省份。
[0004]HCV在分类上归于黄病毒科丙肝病毒属，基因组为单股正链RNA，约由9600个核苷酸组成。HCV基因组可分为3个区域，即5’非编码区(5’NTR，NCR, UTR)、编码区(ORF)、3’非编码区(3’ NTR)。5’ NTR:此区高度保守，是病毒翻译的起始位点，在HCV复制过程中有非常重要的作用。HCV 5’非编码区(5’NTR)含有一个内在核糖体进入位点(internalribosome entry site，IRES)，IRES可指导核糖体进入起始蛋氨酸密码子，体外分析其活性，特别是对开放读码框架(ORF)翻译的启动非常重要。另外，5’NTR还可作为复制信号，或直接与病毒基因组3’端相互作用，或间接参与RNA-蛋白质的相互作用。开放读码框架(ORF):编码约含3010个氨基酸的前体蛋白。包括结构区和非结构区:结构区编码病毒的核心蛋白(C蛋白)和包膜蛋白(El.E2 / Nsl)，又称为机构蛋白，参与病毒的组装；非结构区包括NS2-NS5。编码7种非机构蛋白。在病毒复制和稳定病毒的生物学性状等方面起重要作用。如NSSB蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶，为HCV复制所必需，是抗病毒治疗的重要靶位。3’ NTR中的保守序列可潜在形成三个稳定的茎环结构，是黑猩猩体内HCV复制所必需的结构。由于HCV 3’和5’末端序列在不同HCV株间高度保守，使其成为抗病毒治疗的优选靶位。
[0005]在对HCV进行核酸检测时，一般有三个步骤需要阳性对照:步骤一:提取HCV RNA,主要为病毒外膜及衣壳的破碎，病毒核酸的释放；步骤二:HCV RNA逆转录为cDNA ;步骤三:cDNA与PCR反应液混合，在PCR仪中扩增并得到信号。现有的阳性对照，主要包含下述几种来源:确诊为乙型肝炎患者或被感染动物的阳性血清；体内或体外转录RNA ;质粒或化学合成。所有阳性对照中，最准确可靠的应该是含HCV病毒的天然样本(如患者或被感染动物的血液、细胞培养液)，可充分保证其作为前述三个步骤的阳性对照，但其最大缺陷在于天然样本来源有限，且存在病毒扩散的潜在危害性。体内或体外转录的HCV RNA，可以作为逆转录的阳性对照；但是，由于其不具备病毒外壳，所以不适合作为提取病毒RNA步骤中的阳性对照，且易被环境中普遍存在的RNase降解，不易保存。用质粒作为阳性对照，其优点是制备容易，但由于质粒是DNA，不是RNA，因此它只能作为PCR扩增步骤的阳性对照，而无法作为RNA提取和逆转录的对照。至于化学合成法，成本非常高，没有核衣壳的保护而容易降解，因此不适用于大规模生产。
[0006]所谓人工假病毒颗粒是将目的RNA病毒基因通过扩增及克隆连接至可以诱导表达噬菌体基因的表达载体上，通过诱导表达产生包被有噬菌体衣壳蛋白的目的RNA片断，这种技术又叫做装甲 RNA (Armored RNA)技术(Pasloske B L, et al.Armored RNAtechnology for product1n of ribonucIease-resistant viral RNA controls andstandards[J].J Clin Microb1l,1998, 36(12):3590-3594)。
[0007]目前构建假病毒颗粒常用载体主要为MS2噬菌体和能够高效表达的表达载体。噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。MS2噬菌体是正性单链RNA病毒，属于轻小噬菌体科、轻小噬菌体目、轻小噬菌体属，由外裹蛋白衣壳的核酸组成，是性菌毛RNA大肠杆菌噬菌体的4个血清型中第I血清群的典型代表。MS2噬菌体基因组全长3569碱基对，可编码成熟蛋白、衣壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等四种蛋白质分子。MS2噬菌体能够通过吸附性菌毛(F-pili)感染雄性大肠杆菌，感染后每个细胞能产生13?14个■菌体[van Meerten D, Olsthoorn R C，van Duin J, et al.Peptide display on live MS2 phage: restrict1ns at the RNAgenome level [J], J Gen Virol, 2001, 82:1797-1805.] o 电子显微镜下 MS2 噬菌体直径约27nm[Strauss J H Jr, Sinsheimer R L.Purificat1n and properties of bacter1phage MS2 and of its ribonucleic acid[J].J Mol B1l, 1963,7:43-54.]。一个■菌体颗粒包括180个衣壳蛋白单体、一分子成熟蛋白，包裹一分子基因组RNA组成的正二十面体(贾盘兴.噬菌体分子生物学基本知识和技能[M].北京:科学出版社，2001，2-5)。噬菌体对宿主寄生具有高度特异性，只能侵染一种细菌中的某一菌株。MS2噬菌体的宿主是大肠杆菌，在人和动物的排泄物或污染的井水、河水中广泛存在[Theitler D J, NasserA, Gerchman Y, et al.Synergistic effect of heat and solar UV on DNA damageand water disinfect1n of E.coli and bacter1phage MS2[J].J Water Health,2012， 10:605-618]。
【发明内容】
[0008]本发明中提到的一种含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒，由MS2噬菌体衣壳蛋白包裹丙型肝炎病毒RNA的一种RNA-蛋白复合体；其内含有丙型肝炎病毒5’ UTR基因序列，具有耐核糖核酸酶的特性，并且易于制备、保存和运输，可作为丙型肝炎病毒基因诊断试剂盒中的标准品和质控品。
[0009]一种含丙型肝炎RNA片段的假病毒颗粒的制备方法，其具体制备步骤为: 步骤一、PET-MS2重组子的构建
1)依照GenBank数据库中的MS2噬菌体基因序列(NC_001417)，自主设计扩增成熟蛋白和衣壳蛋白融合基因的引物MS2F、P2、P3及MS2R并进行人工合成，序列分别为:
MS2F:5 ' -CGGGATCCGTTTGACCTGTGCGAGCTTTTAGTA-3 '，
P2:5 ; -GGAACCTGGAGACTATCTAGAGAGCCGTTGCCTGATT-3 '，
P3:5 ; -TCTCCAGGTTCCCCGGAGTTTGAAGCATGGCTTCTAA-3 '，
MS2R:5 ' -CCCAAGCTTCAATACATAAAGAGTTGAACTTCTT-3 '，
下划线所指为上下游引物分别引入的BamH I和Hind III酶切位点；然后通过重叠剪接PCR的方法扩增出成熟蛋白和衣壳蛋白基因(MS2基因)，其