利用人工合成mv5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法
【技术领域】 [0001] 本发明涉及一种培育甘蔗抗病品种的方法，具体涉及一种利用人工合 成MV5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，属于生物。
【背景技术】 [0002] 甘鹿（Saccharum officinarum)是最重要的糖料作物，鹿糖占我国食 糖总产的90%以上。甘蔗花叶病是甘蔗上发生最普遍、危害最严重的一类病毒病害，它主 要破坏甘蔗叶片的叶绿体，严重制约其光合作用，从而使甘蔗的生长受到限制，造成产量 降低5% -19%、节间变短、品质变劣和品种退化。该病病原复杂，可由多种病毒引起，主 要为甘鹿花叶病毒（Sugarcane Mosaic Virus, ScMV)和高梁花叶病毒（Sorghum Mosaic Virus，SrMV)，属马铃薯Y病毒属（Potyvirus)成员，为单链正义RNA病毒，基因组结构简 单，编码10个成熟蛋白，分别为PI、HC-pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、Nib和CP。且该病 的侵染病毒极易分化，不同地区的分离物或株系均存在差异。在1997年已报道至少存在7 个株系，包括属于ScMV的株系ScMV-A，B，D，E和属于SrMV的株系SrMV-H，I，M，这些不同株 系的病毒均可引起甘蔗花叶病的发生。因此，仅以单一株系的花叶病毒的单一基因为靶标 的转基因改良显然无法应对蔗区病原株系多样化、复杂化以及优势株系的变化。
[0003] RNA干扰（RNA interference，RNAi)是一种转录后基因表达沉默机制，构建可转 录为双链RNA(dsRNA)的植物表达载体转化植物，可实现植物目标基因的可遗传的基因沉 默，用于基因功能鉴定和创造分子育种新材料。而且，引发RNAi的片段并不需要完整的基 因序列，还可以是多个病毒的不同基因片段的嵌合体，因此，RNAi针对的靶标基因也可以是 多个不同病毒的基因片段。为此，我们采用RNAi技术，将收集到的ScMV各病毒株系的核酸 序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对，并从多序列比对结果中分别选 出两条100%同源的序列区段，采用人工合成的方式串联在一起，作为RNAi干扰片段，构建 反向重复序列，得到一个RNAi载体。通过基因枪轰击法遗传转化甘蔗，以获得具有沉默病 毒基因表达效果的转基因甘蔗。
[0004] 专利号为ZL20071009226. 8的发明专利"利用SrMV-Pl基因培育抗花叶病甘蔗品 种的方法"，介绍了一种利用SrMV-Pi基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SrMV-P i基因 的克隆、抗花叶病甘蔗转Pi基因植物表达载体的构建、抗甘蔗花叶病转P :基因材料的培育 以及抗病高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用人工合成序列MV5培育抗花叶病甘蔗品 种的方法。针对现有蔗区甘蔗花叶病严重的问题，人工合成可同时沉默甘蔗花叶病毒和高 粱花叶病毒的新型核酸序列，构建RNAi载体，通过基因枪轰击法进行遗传转化，获得对花 叶病高抗的转基因甘蔗。
[0006] 本发明的目的是通过以下方法实现的。
[0007] 本发明的利用人工合成MV5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV5序列的 人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在 于：
[0008] (1)MV5序列的人工合成：
[0009] 从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，获得MV5序列，同时在正义 链5'端加入Xba I和Xho I酶切位点，反义链5'端加入Cla I和Kpn I酶切位点，采用 人工合成的方式，获得目的片段A，其序列如下：
[0010] GATCTAGACT CGAGGCATCT CCAACATTCA GACAGATAAT GCACCACTTT AGTGATGCAG CTGAAGCGTA CATAGAGCGT AGATTTAGGC GCAATGTACA ATATCTCAGC TACGCATCAA ATATCAAGTT TAGTGCAGAA AAGTCGAGAT GTTCGGTCTG GACGGAAATG TCGGCGAGAC TCAGGAGAAT ACAGAGAGAC ACACAGCTGG TTAACCGTGA GAAAAAGCGT AGATTTAGGC GCTGTATACA ATATATCAGC TACGCATCTA ATATCAGGTA CCATCGATAG
[0011] 所述从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，指分别将收集到的 ScMV各个病毒株系的核酸序列和SrMV各个病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对，从 中分别各选取2条长度大于40bp，且100%同源的序列区段串联在一起，共262bp，为目标 RNAi干扰序列。
[0012] (2) RNAi干扰载体构建：
[0013] (a)目的片段I的获得：利用限制性内切酶Kpn I和Xho I将目的片段A进行酶 切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段I ;目的片段I的序列为序列 表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
[0014] (b)目的片段II的获得：将pHANNIBAL载体质粒DNA用限制性内切酶Kpn I和Xho I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段II，目的片段II的序 列为序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列；
[0015] (c)中间载体B的获得：将回收的目的片段I和目的片段II用T4-DNA连接酶进行 连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体B ;所述中 间载体B是指将目的片段I插入到pHANNIBAL载体后获得的载体；
[0016] ⑷目的片段III的获得：提取中间载体B的质粒DNA，并用限制性内切酶Cla I和 Xba I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段III ;目的片段III 的序列为序列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；
[0017] (e)目的片段IV的获得：将目的片段A用限制性内切酶Cla I和Xba I进行酶切， 将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段IV ;目的片段IV的序列为序列表 中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
[0018] (f)中间载体C的获得：将回收的目的片段III和目的片段IV用T4-DNA连接酶进行 连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体C ;所述中 间载体C是指将目的片段IV插入到中间载体B后获得的载体；
[0019] (g)目的片段V的获得：提取中间载体C的质粒DNA，并用限制性内切酶Not I进 行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段V ;目的片段V的序列为 序列表中SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；
[0020] (h)目的片段VI的获得：将植物表达载体pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶 Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段VI ;目的片段VI 的序列为序列表中SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列；
[0021] ⑴抗甘蔗花叶RNAi干扰载体pG0229i-MV5的获得：将回收的目的片段V和目的 片段VI用T4-DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5 a中，挑取阳性克隆 验证，获得可用于遗传转化甘蔗受体材料的RNAi干扰载体pG0229i-MV5 ;
[0022] (3)抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定：提取构建完成的RNAi干扰载 体pG0229i-MV5质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1 y g/ y 1， 基因枪轰击法遗传转化甘蔗，分子检测获得阳性转基因植株，并进行抗病转基因甘蔗的抗 病性鉴定。
[0023] 所述pHANNIBAL载体、pGreenII0229载体、大肠杆菌DH5a，均由商业购买获得。
[0024] 利用本发明的人工合成MV5序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，在人工接种条件 下，分别接种了属于ScMV株系的ScMV-A，D和属于SrMV株系的SrMV-I，M共4个株系，对照 发病率分别达到了 84. 6%、85. 7%、87. 5%和86. 9%，而转基因甘蔗均无发病，说明转入人 工合成的MV5基因后提高了甘蔗抗多种花叶病毒的能力。采用本发明的方法筛选获得的转 基因植株，都具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高的特点。
[0025] 本发明的优点和有益效果：
[0026] 1.本发明获得的植物表达载体采用了 RNAi技术，使得甘蔗抗病毒育种摆脱了对 抗源基因的依赖。
[0027] 2.本发明人工合成的核酸序列包含2段与ScMV各病毒株系核酸序列100%同源 和2段与SrMV各病毒株系核酸序列100%同源的序列区段，作为RNAi序列，获得的转基因 植株，具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特点。
[0028] 3.本发明获得的RNAi干扰载体用于转基因甘蔗，可以有效地缩短甘蔗抗花叶病 育种周期。
【附图说明】 [0029] 图1为构建完成的pG0229i-MV5质粒图谱。
[0030]
【具体实施方式】为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以 说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和生物材料如 无特殊说明均可从商业途径获得。
[0031] 实施例一：构建抗甘蔗花叶病的RNAi干扰载体
[0032] 构建抗甘蔗花叶病的RNAi干扰载体的方法，包括以下步骤：
[0033] 1、MV5序列的人工合成：
[0034] 将收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分别进行 多序列比对，从中分别选取2条长度大于40bp且100%同源的序列区段，然后将选取出来的 4条序列区段采用人工合成的方式串联在一起，共262bp，即为目标RNAi干扰序列；同时在 拟人工合成序列的正义链5'端加入Xba I和Xho I酶切位点，反义链5'端加入Cla I和 Kpn I酶切位点，人工合成获得目的片段A ;所述目的片段A是指在目标RNAi干扰序列的正 义链5'端和反义链5'端加入酶切位点后的核苷酸序列；人工合成后，目的片段A的序列 为序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0035] 2、RNAi干扰载体构建：
[0036] 利用限制性内切酶Kpn I和Xho I将步骤1中获得的目的片段A进行酶切，将酶 切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段I，同时将pHANNIBAL载体质粒DNA 用限制性内切酶K