一种多基因多靶点富集方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测技术领域，具体设计一种多基因多靶点富集方法，用于高通 量测序甲状腺样本的靶向制备。
【背景技术】
[0002] 甲状腺癌是内分泌系统和头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤。每年甲状腺癌新发病 例占所有癌症发病的1% -5%，女性甲状腺癌发病高于男性，约是男性的3倍，甲状腺癌的 发病年龄相对年轻，发病率随年龄的增长而上升。近30年来，甲状腺癌发病率持续快速增 长，引起了人们的广泛关注。
[0003] 甲状腺癌根据其病理特点分为乳头状癌（PTC)、滤泡性癌（FTC)、Hnrthle细胞 癌、髓样癌（MTC)，未分化癌（ATC)等，其中甲状腺乳头状癌为主要类型，占甲状腺癌的 79% -94%，绝大多数甲状腺癌患者预后良好，其5、10和30年生存率分别为97%、93%和 76%〇
[0004] 未分化癌虽然少见，但恶性程度高，预后差。尽管多数甲状腺癌预后良好，但患者 通常会接受甲状腺的全切术，终身服用甲状腺素以及可能的放射性碘消融术，进而使患者 面临喉返神经损伤、甲状旁腺功能低下及终身服用促甲状腺激素（TSH)抑制剂带来的多种 并发症风险，同时甲状腺癌易复发，约20%的甲状腺癌患者会面临二次手术或多次手术的 风险。大于lcm甲状腺结节建议做细针穿刺（FNA)，不能确诊的建议重复穿刺。回顾性研宄 表明，细针穿刺良性诊断假阴性率仅为1-2%。即使在病灶大于lcm的病人中，如果诊断为 高分化型甲状腺癌，如甲乳癌，延迟手术至病灶增大或局部转移时比起马上手术并未降低 病人的长期生存时间，尤其对于中老年患者。
[0005] 研宄表明5-10%的甲状腺非髓质癌（甲乳癌或滤泡状甲状腺癌）有较明显的 家族性，通常在乳头状癌中，家族性非髓性甲状腺癌最常见，约占所有乳头状癌发病的 6. 2%-10. 5%。家族性的甲状腺癌通常比散在发生的甲状腺癌预后差。甲状腺癌也可见于 基因存在某些缺陷者，比如乳头状癌可见于家族性腺瘤性息肉病，多发性内分泌腺瘤2型 以及其亚型Gardner' s综合征患者中。
[0006] 由于绝大多数甲状腺癌患者预后良好，因而关注外科治疗带来的并发症显得尤为 重要，包括甲状腺切除后的低钙血症，TSH抑制疗法长期应用后的一系列副反应以及由于喉 返神经损伤带来的明显发声改变。
[0007] 有研宄表明甲状腺癌切除术后有部分患者会导致暂时性以及永久性低钙血症的 发生，低钙血症通常会带来皮肤异样感、肌肉抽搐以及痉挛等表现。对于严重的病例，通常 会进展为手足抽搐以及心律失常等。长期的甲状旁腺功能低下会导致肾脏损伤，基底节钙 化以及骨破坏。喉返神经麻痹是另一个潜在的甲状腺切除术后的并发症，可以影响患者发 声，吞咽以及吸气困难。可能导致暂时性以及永久性喉返神经损伤的发生，影响患者术后发 声质量的其他因素还包括喉上神经损伤，声带肌肉损伤以及呼吸道刺激或水肿。甲状腺切 除带来术后的声音改变能够显著影响患者的个人生活。
[0008] 此外，甲状腺癌术后应用TSH抑制剂，经研宄观察，在术后一年会使女性患者的骨 密度降低，另外，对于那些在确诊甲状腺癌前即患有骨以及心血管疾病的患者，目前没有针 对这类患者的TSH抑制方案推荐。因而，对于这些患者，临床医生应该权衡甲状腺癌复发带 来的死亡以及骨和心血管疾病带来的死亡，哪一种风险更大。
【发明内容】
[0009] 针对甲状腺癌的现状，本发明旨在提供一种多基因多靶点富集方法，通过采用本 发明方法以及专门设计的捕获探针库进行基因检测，获得更高的重复性与准确性的检测结 果，并且可以检测Amplicon技术难以检测的基因融合/重排。
[0010] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0011] 一种多基因多靶点富集方法，包括如下步骤：
[0012] SI gDNA片段化和加接头adaptor
[0013] 1. 1)准备所需试剂如下：
[0014] SureSelect QXT 终止反应液、SureSelect QXT 缓冲液、SureSelect QXT 转座酶溶 液、二甲基亚砜（DMS0)、AMPure XP磁珠、乙醇；
[0015] 1. 2)定量待建库样本，调整浓度至25ng/yL，体积2yL ;
[0016] 1. 3)PCR仪设置DNA片段化程序，设好程序后，点击开启，再立即点击暂停；
[0017] 1. 4) SureSelect QXT缓冲液和SureSelect QXT转座酶溶液分别高速涡旋混匀备 用；
[0018] 1. 5)将SureSelect QXT缓冲液、样本和SureSelect QXT转座酶溶液依次添加到 PCR管中，于冰上操作配制片段化反应体系，每种试剂单独添加；配制完成后，短暂离心，再 高速涡旋充分混匀20s，并再次短暂离心，完成后立即将PCR管放置于步骤1. 3)中暂停的 PCR仪上，重新启动反应程序；
[0019] 1.6)?〇?完成后，立即将其转移至冰上；然后往其中加32 1^1乂511代5616(^0乂1'终 止反应液，高速涡旋5s，短暂离心，室温孵育lmin ;
[0020] S2 AMPure XP 磁珠纯化
[0021] 2. 1)将AMPure XP磁珠在使用前充分混匀并平衡至室温；
[0022] 2. 2)将步骤S1中得到的已片段化和加接头adaptor的样本转移至新的1. 5mL EP 管中；
[0023] 2. 3)加入52 y L充分混匀的AMPure XP磁珠，涡旋5s，短暂离心，保证磁珠没有沉 底；
[0024] 2. 4)置于混匀仪上室温孵育5min ;
[0025] 2. 5)孵育好的样本短暂离心，放磁力架上吸附磁珠，时间为3-5min，弃上清；
[0026] 2. 6)加300 y L现配的70%乙醇，计时lmin，期间沿水平方向缓慢旋转EP管一圈， 令干扰的磁珠下沉，弃上清；
[0027] 2. 7)重复步骤 2. 6) -次；
[0028] 2.8)短暂离心，将EP管重新放回磁力架静置30s，使用P10移液器除净残留乙醇；
[0029]2. 9) 37°C烘干磁珠，时间为l_3min，或置于通风厨l-3min使磁珠干燥；干燥完成 后，加36 y L不含核酸酶的水，涡旋混匀，短暂离心；
[0030] 2. 10)室温孵育2min，放置磁力架上，取一定量上清至新的PCR管中，放置冰上，至 此得到纯化样本；
[0031] S3 捕获前 PCR
[0032] 3. 1)所需试剂如下：
[0033] Herculase II Fusion DNA聚合酶、5XHerculase II反应缓冲液、每个三磷酸脱 氧核糖核苷（dNTP)25mM 的 lOOmM dNTP 混合液、SureSelect QXT 引物混合物、DMSO、AMPure XP磁珠和乙醇；
[0034] 3. 2)在冰上操作，将5XHerculase II反应缓冲液、每个dNTP25mM的lOOmM dNTP 混合液、DMSO、SureSelect QXT引物混合物、Herculase II Fusion DNA聚合酶配制捕获 前PCR反应混合液，一次反应中各试剂的剂量依次为10 y L、0. 5 y L、2. 5 y L、1 y L、1 y L和 15 y L ；
[0035] 3. 3)将步骤3. 2)制得的捕获前PCR反应混合液加入35 y L步骤S2中得到的纯化 样本中，涡旋5s混匀；然后放置于PCR仪上，设置PCR反应程序并启动；反应完毕后得到捕 获前PCR样本并放置冰上；
[0036] S4 AMPure XP 磁珠纯化
[0037] 4. 1)将XP磁珠在使用前充分混匀并平衡至室温；
[0038] 4. 2)将步骤S3得到捕获前PCR样本转移至新的1. 5mL EP管中；
[0039] 4. 3)按照步骤2. 3)-2. 10)进行操作，最终得到预文库；
[0040] S5将步骤S4得到预文库进行质量检测和浓度检测，包括预文库DNA的片段大小是 否主要分布在245-325bp、以及DNA浓度是否满足彡500ng