Erythroferrone和erfe多肽以及调控铁代谢的方法
【专利说明】ERYTHROFERRONE和ERFE多肽以及调控铁代谢的方法
[0001] 经由EFS-WEB提交的序列表的引用
[0002] 大小为14. 3kb的创建于2013年10月28日且与本申请一起经由EFS-Web电子提 交的、名称为"20131031_034044_119W01_seq_ST25"的序列表的ASCII文本文件的内容通 过引用方式整体并入本文中。
[0003] 对于政府支持的致谢
[0004] 本发明是在美国国立卫生研宄院（National Institutes of Health)的国立糖尿 病消化与肾脏疾病研宄所（National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases，NIDDK)授予的资助号R01 DK082717和R01 DK 065029的政府支持下完成的。政 府对本发明拥有一定的权利。
[0005] 发明背景 1.发明领域
[0006] 本发明涉及调控铁代谢的多肽以及制备和使用该多肽的方法。
[0007] 2.相关领域的描述
[0008] 红细胞生成目前为止是机体内铁的主要消耗者。尤其已经由Finch等人在50年 多年以前提出存在响应红细胞生成需求而调控铁的激素。参见Finch1994。令人遗憾的 是，Finch和其它人从未发现任何此类激素。
[0009] 其它研宄者研宄了在地中海贫血中铁吸收增加的原因，并且提出两种物质⑶F15 和TWSG1可导致该疾病中铁调素抑制和铁超负荷，但推论这并不是铁吸收的生理信号。参 见Tanno2010b和Casanovas2013。⑶F15或TWSG1在地中海贫血的铁超负荷中的作用从 未具体说明。
[0010] 发明概述
[0011] 在一些实施方案中，本发明涉及经分离的、经纯化的、合成和/或重组多肽，该多 肽包含与SEQIDNO: 16具有约95-100%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约 99%序列同一性的C-末端序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与SEQIDN0:17具有约 70-100 %、至少约80 %、至少约90 %或至少约95 %序列同一性的N-末端序列。在一些实施 方案中，本发明涉及经分离的、经纯化的、合成和/或重组多肽，该多肽基本上由以下序列 组成或者由以下序列组成：与SEQIDNO: 16具有约95-100%、至少约96%、至少约97%、至 少约98%或至少约99%序列同一性的C-末端序列和与SEQIDNO: 17具有约70-100%、至 少约80 %、至少约90 %或至少约95 %序列同一性的N-末端序列。在一些实施方案中，本发 明涉及经分离的、经纯化的、合成和/或重组多肽，该多肽与SEQIDN0:1或SEQIDN0:2具 有约70至100 %、至少约80 %、至少约90 %或至少约95 %序列同一性。在一些实施方案中， 本发明涉及经分离的、经纯化的、合成和/或重组多肽，该多肽包含至少一种以下序列、基 本上由至少一种以下序列组成或者由至少一种以下序列组成：SEQIDN0:3，SEQIDN0:4， SEQIDN0:5，SEQIDN0:6，SEQIDN0:7，SEQIDN0:8，SEQIDN0:9，SEQIDN0:10，SEQ IDNO: 11，SEQIDNO: 12,SEQIDNO: 13,SEQIDNO: 14 和SEQIDNO: 15,其中X为任何氨 基酸。在一些实施方案中，本发明涉及经分离的、经纯化的、合成和/或重组多肽，该多肽包 含所有以下序列、基本上由所有以下序列组成或者由所有以下序列组成：SEQIDN0:3，SEQ IDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQID 勵：10,5￡〇10勵：11，5￡〇10勵：12,5￡〇10勵：13,5￡〇10勵：14和5￡〇10勵：15，其中 X为任何氨基酸。在一些实施方案中，当向人受试者施用时，本发明的多肽降低在人受试者 中的肝铁调素mRNA和/或血清铁调素水平。在一些实施方案中，本发明的多肽表现出与 SEQIDN0:1 或SEQIDN0:2 的erythroferrone活性相同或者基本类似的erythroferrone 活性。在一些实施方案中，本发明的多肽表现出由SEQIDNO: 1或SEQIDN0:2提供的 erythroferrone活性的约 60-100%、约 70-100%、约 80-100%、约 90-100%或约 95-100% 的erythroferrone活性。
[0012] 在一些实施方案中，本发明涉及经分离的、经纯化的、合成和/或重组多肽，该多 肽包含以下残基、基本上由以下残基组成或者由以下残基组成：至少约10、至少约11、至少 约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约 20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24或至少约25个SEQIDNO: 1、SEQIDN0:2 或SEQIDNO: 16的连续氨基酸残基。
[0013] 在一些实施方案中，使用合成或重组技术来制备本发明的多肽。
[0014] 在一些实施方案中，本发明涉及经经分离的、经纯化的、合成和/或重组核酸分 子，该核酸分子包含编码根据本发明所述的多肽的序列、基本上由编码根据本发明所述的 多肽的序列组成或者由编码根据本发明所述的多肽的序列组成。
[0015] 在一些实施方案中，本发明涉及重组细胞，该重组细胞能够表达根据本发明所述 的多肽和/或包含编码根据本发明所述的多肽的核酸分子。
[0016] 在一些实施方案中，本发明涉及抗体，该抗体针对根据本发明所述的多肽产生。所 述抗体可以为单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体为人源化抗体、嵌合抗体或人抗 体。
[0017] 在一些实施方案中，本发明涉及组合物，该组合物包含以下物质、基本上由以下物 质组成或者由以下物质组成：根据本发明所述的多肽和/或编码根据本发明所述的多肽的 核酸分子和/或针对根据本发明所述的多肽产生的抗体。在一些实施方案中，所述组合物 以比在正常受试者中存在的浓度更高的浓度包含根据本发明所述的多肽和/或编码根据 本发明所述的多肽的核酸分子和/或针对根据本发明所述的多肽产生的抗体。
[0018] 在一些实施方案中，本发明涉及在受试者中治疗铁代谢疾病的方法，该方法包括 以下步骤、基本上由以下步骤组成或者由以下步骤组成：施用至少一种根据本发明所述的 多肽、编码根据本发明所述的多肽的核酸分子、针对根据本发明所述的多肽产生的抗体或 者包含根据本发明所述的多肽的组合物。在一些实施方案中，所述受试者为人。在一些实 施方案中，所述受试者需要该方法。如本文所使用，"有需要的受试者"是已经被诊断具有或 患有铁代谢疾病的受试者。在一些实施方案中，铁代谢疾病是铁超负荷疾病或者与异常低 水平的铁调素相关的疾病和/或病症。在一些实施方案中，铁代谢疾病是与异常低水平的 铁和/或异常高水平的铁调素相关的疾病或病症。在一些实施方案中，向受试者施用的多 肽为-ERFE多肽。在一些实施方案中，向受试者施用的多肽为+ERFE多肽。在一些实施方 案中，施用有效量、优选治疗有效量的一种或多种多肽。在一些实施方案中，该方法包括以 下步骤、基本上由以下步骤组成或者由以下步骤组成：通过向受试者施用有效量、优选治疗 有效量的ERFE多肽来调控在受试者中铁调素的量。在一些实施方案中，该方法包括测量在 施用之前、之中或之后在受试者中的一种或多种ERFE多肽和/或铁调素的量。在一些实施 方案中，使用测定来测量ERFE多肽的量，该测定使用编码根据本发明所述的多肽的一种或 多种核酸分子和/或针对根据本发明所述的多肽产生的一种或多种抗体。在一些实施方案 中，该方法包括向受试者施用铁调素的测量值高于正常值时的一种或多种+ERFE多肽或者 铁调素的测量值低于正常值时的一种或多种_ERFE多肽。
[0019] 在一些实施方案中，本发明涉及测定，该测定用于检测在样品中ERFE多肽的存在 和/或测量在样品中ERFE多肽的量，该测定包括使样品与针对根据本发明所述的多肽产生 的抗体接触，然后检测结合抗体的存在和/或测量结合抗体的量。
[0020] 在一些实施方案中，本发明涉及试剂盒，该试剂盒包括与试剂、装置、指导材料或 者其组合一起包装的至少一种根据本发明所述的多肽、编码根据本发明所述的多肽的核酸 分子、如本文所公开的重组细胞、针对根据本发明所述的多肽产生的抗体或者如本文所公 开的组合物。
[0021] 在一些实施方案中，本发明涉及杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系能够表达特异性 识别根据本发明所述的多肽的抗体或者针对根据本发明所述的多肽产生的抗体。
[0022] 在一些实施方案中，本发明涉及复合物，该复合物包含结合抗体的至少一种根据 本发明所述的多肽，其中所述至少一种多肽和/或抗体通过重组技术制备。
[0023] 在一些实施方案中，本发明涉及一种或多种根据本发明所述的多肽、编码根据本 发明所述的多肽的核酸分子、针对根据本发明所述的多肽产生的抗体或者包含所述多肽、 核酸分子和抗体中的一种或多种的组合物在制备治疗铁代谢疾病的药剂中的用途。
[0024] 在一些实施方案中，本发明涉及一种或多种根据本发明所述的多肽、编码根据本 发明所述的多肽的核酸分子、针对根据本发明所述的多肽产生的抗体或者包含所述多肽、 核酸分子和抗体中的一种或多种的组合物在治疗铁代谢疾病中的用途。
[0025] 发明详述
[0026] 前面的概述和以下的详述都仅为示例性和说明性，并且意在对要求保护的本发明 提供进一步的解释。附图被包括以进一步理解本发明并在此引入本说明书，并且组成本说 明书的一部分、说明本发明的一些实施方案及与说明书一起用于解释本发明的原理。
[0027] 附图描述
[0028] 通过参考附图进一步理解本发明，其中：
[0029] 图1:相对于未经处理的动物，在红细胞生成刺激（静脉抽血（实线）或EPO注射 (虚线））之后肝Hamp mRNA受到抑制。使用6周龄雄性小鼠，n=4/组。*p〈0. 05，**p〈. 01， #*p〈.001，通过学生t检验与未经处理的动物比较。
[0030] 图2 :健康人志愿者对在第2天9AM时给予EPO5000U的响应（Ashby2010)。
[0031] 图 3A-3B:ERFE是TNF-a超家族的成员。图 3A:小鼠（SEQIDNO:2)和人ERFE 蛋白（SEQIDNO: 1)的比对。突出显示的序列是SEQIDNO: 16。进行人ERFE的C-末端 区段与TNF家族的其它人成员和ERFE的人变体的彩色CLUSTAL比对。发现，ERFE的人变 体在信号序列上不同。因此，根据本发明所述的ERFE多肽包含与如SEQIDNO: 16所示的 N-末端区段的90-100 %，优选95-100 %，更优选98-100 %和最优选99-100 %序列同一性。 图3B:基于与TNFa超家族其它成员的类似性的ERFE的结构模型。
[0032] 图4:与未经处理的小鼠相比，在静脉抽血（实线）或EPO注射（虚线）之后骨髓 ErfemRNA增加倍数。使用6周龄小鼠，n= 4/组。*p〈. 001，**p〈. 01，通过t检验与未经处 理的动物比较。图5:人ERFE是在中幼红细胞中最大程度表达的红细胞系转录物。图5A显 示在各种组织中按照强度顺序的相对的人ERFEmRNA表达。胎儿肝脏和骨髓，高水平表达人 ERFEmRNA的器官，含有成红细胞。图5B基于人成红细胞成熟数据库（HumanErythroblast MaturationDatabase，Merryweather-Clarke2011)。显不了从红细胞类菌落形成单位 (CFU-E)(红细胞发育的极早期阶段）到原成红细胞（Pro-E)、中幼红细胞（Int-E)到晚幼 红细胞（LateE)的成熟人成红细胞中人ERFEmRNA的相对表达。
[0033] 图6 :通过Socolovsky方法（Liu2006)分类为原成红细胞（ProE)和成红细胞 EryA、B、C阶段的小鼠骨髓成红细胞中的ErfemRNA表达。白柱表示来自在静脉抽血0.5ml 之后15小时的C57BL/6小鼠的骨髓；而黑柱表示来自未经操作的对照小鼠的骨髓。六周龄 雄性小鼠，n= 3/组，*p〈0. 01，通过t-检验。
[0034] 图7A-7C:在静脉抽血的Erfe+/+、Erfe-和Erfe+小鼠（标记为WT(野生型，图 7A)、HT(杂合体，图7B)和K0(敲除，图7C))的肝脏中HampmRNA的改变。n= 3至6只小 鼠/组。与未行静脉抽血的对照相比，*P〈. 001，**P〈. 01，通过t-检验。
[0035] 图8:缺乏Erfe的小鼠显示从贫血中恢复延缓（A和B)。与野生型小鼠相比（虚 线），经静脉抽血的缺乏Erfe的小鼠（实线）显示出血红蛋白恢复延缓和较低的平均红细 胞血红蛋白量（MCH)。通过学生t检验比较WT(n= 17)和K0(n= 15)之间每次测量的 血液参数（A，B)。在没有性别差异的情况下，将每一参数的两种性别合并。***p〈0. 001， **p〈0. 01，*p〈0. 05。
[0036] 图9A-9C:图9A:用0.5或1yg质粒DNA转染的HEK293T细胞，该质粒DNA编码 融合到C-末端6His标记的小鼠ErfecDNA。使用抗-6His抗体的蛋白质印迹检测到Erfe 主要在上清液中，这表明分泌了大量的Erfe。图9B:分泌的Erfe为N-和0-糖基化的。图 9C:在蛋白质印迹中针对内部肽序列PSRVPAAQEL(SEQIDN0:18)产生的兔抗小鼠抗-Erfe 抗体2检测重组蛋白，其中+/-表明经Erfe质粒转染或不经Erfe质粒转染。
[0037] 图10 :Erfe直接作用于肝脏来抑制铁调素。（A，B，C)使用小鼠重组Erfe(2yg/ g)或盐水经腹腔处理六只C57BL/6雄性小鼠，并在15小时之后分析。肝铁调素mRNA(A) 和血清铁调素（B)水平均显著受到Erfe处理抑制，尽管肝脏SaalmRNA表达（C)增加表明 出现了炎症反应。（D，E，F)使用编码GFP或小鼠ErfecDNA序列的慢病毒来转导八只7周 龄C57BL/6雄性小鼠。（D)在用Erfe慢病毒转导的小鼠的肝脏中ErfemRNA表达仅轻度 增加（与使用红细胞生成刺激的小鼠骨髓中32倍上调相比，仅为基线骨髓水平的2倍）， 但是该增加足以降低肝铁调素mRNA(E)和血清铁调素（F)水平。（G)如通过使用抗-FLAG 抗体的蛋白质印迹检测到，通过使用Erfe慢病毒感染的HEK293T细胞分泌重组小鼠Erfe。 (H)使用来自对照细胞或者过表达Erfe的HEK293T细胞的上清液（50%v/v)对小鼠原代肝 细胞处理表明Erfe直接作用于肝脏以抑制铁调素mRNA表达。显示了一式三份经15小时 处理的3个独立实验的平均值土SEM。通过qRT-PCR来测量铁调素（Hamp)、血清淀粉样蛋 白l(Saal)和ErfemRNA(Erfe)水平。显不-ACt(艮P，CtHprt-CtHamp，Saal或Erfe) 的平均值土SEM。通过酶联免疫吸附测定来测量血清铁调素水平（B，F)。通过学生t检验 来比较经处理的小鼠和对照小鼠之间或者经Erfe处理的样品和对照样品之间的平均值。 ***p〈0. 001，**p〈0. 01，*p〈0. 05。
[0038] 图11 :与野生型小鼠（WT)(n= 5)相比，在中间型0-地中海贫血th3/+小鼠 (thal)(n= 4)的骨髓和脾脏中ErfemRNA增加。使用6月龄雄性小鼠。*p= 0. 016， **p〈0.001。将Hprt用作参考基因。
[0039] 图12 :Erfe的预测结构结构域。SP=信号肽；NTD=N-末端结构域1和2。
[0040] 发明详述
[0041] 本发明基于在本文中被称为"Erythroferrone"的蛋白的发现。Erythroferrone 开始被鉴定为在受试者中介导红细胞生成以及铁吸收和分布的"激素"。Erythr