一种制备原薯蓣皂苷的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药技术领域，涉及化学领域化合物的分离提取方法，具体涉及植物天然药理活性物质原薯蓣皂苷的一种制备方法。
【背景技术】
[0002]穿山龙是薯菌科植物穿龙薯菌D1scoreanipponicaMakino的干燥根莖，性温，味甘、苦，归肝、肾、肺经，具有祛风除湿、舒筋通络、活血止痛、止咳平喘之效。民间多用其泡酒或煎服，治疗风湿弊病、关节肿痛、跌打损伤和闪腰岔气。现代研究表明穿山龙有调节免疫、改善心血管功能、镇咳、平喘、祛痰等多种药理作用，临床用于治疗类风湿性关节炎、冠心病、高血压、心肌硬塞、支气管哮喘。穿山龙中主要有效成分为留体皂苷,而留体皂苷主要为薯蓣皂苷和原薯蓣皂苷。
[0003]原薯蓣皂苷(protod1scin)，分子式为C51H84O22，结构见图1，属于甾体皂苷，又名呋喃固醇皂苷，有很强的药理作用，如增强性功能、降血脂作用、对癌细胞的毒杀作用和抗白血病作用。目前，尚未有一种适合产业化生产同时制备高纯度原薯蓣皂苷的工艺路线披露。市场上原薯蓣皂苷的产量很低，得率较小，难以满足科研或新药研发需求，从而严重限制其深入研究。本发明利用大孔吸附树脂柱层析、反相硅胶柱层析以及反相树脂基柱层析技术，从穿山龙中制备原薯蓣皂苷，纯度好，得率较高，为其开发利用提供良好的物质基础。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种制备高纯度原薯蓣皂苷的方法，本发明方法不仅操作工艺简单，生产周期短，而且利用本发明可在一个工艺流程中制备得到纯度达到90%以上的原薯蓣皂苷。
[0005]为了解决上述问题，本发明提供一种制备原薯蓣皂苷的方法，包括依次以大孔吸附树脂柱层析、反相硅胶柱层析、反相树脂基柱层析的方法来分离穿山龙药材提取液中的原薯蓣皂苷。
[0006]一种制备原薯蓣皂苷的方法，包括以下步骤:
[0007]I)将干燥的穿山龙药材加入到提取溶剂中，对药材进行提取处理，得到穿山龙提取液，将提取液浓缩、静置、过滤，取滤液；
[0008]2)将滤液采用洗脱剂通过大孔吸附树脂柱法进行洗脱处理，收集、合并含有原薯蓣皂苷的洗脱液，得到树脂柱洗脱液；
[0009]3)将树脂柱洗脱液浓缩、静置、过滤，得到滤液；
[0010]4)将滤液采用洗脱剂通过1-3次反相硅胶柱层析处理，收集、检测、合并洗脱液；
[0011]5)将反相硅胶柱洗脱液浓缩，浓缩液采用反相树脂基柱层析处理，收集、检测、合并洗脱液，洗脱液干燥后，得到原薯蓣皂苷。
[0012]所述的步骤I)中的提取溶剂选取质量百分比浓度为20%_90%的乙醇溶液，优选为50%-75%含水乙醇溶液。不宜采用水、甲醇或者含水甲醇提取，文献报道原薯蓣皂苷用甲醇回流提取时不稳定，会发生转化反应(参见Kostoval, DinchevD, RentschGH, etal.Z.Naturforsch.57c, 33-38(2002))。
[0013]所述的步骤I)中的提取处理是通过加热回流来进行提取处理，其中，提取溶剂的体积与药材的重量之比为5-8:1 (即如果药材的重量为1kg，则提取溶剂的体积为5-8L ；如果药材的重量为lg，则提取溶剂的体积为5-8mL);提取次数为2-3次，优选为2次；提取时间为2-3h/次；另外，步骤I)中所述的将提取液浓缩是将提取液浓缩至相对密度为
1.0-1.2 ;所述的静置是将浓缩提取液静置过夜(浓缩提取液的相对密度范围以及静置时间有利于杂质沉淀完全，便于后述分离制备)。
[0014]所述的步骤2)中的大孔吸附树脂所采用D101、AB-8、DM130H、XAD-2、D201、HP-20、X-5、H103、DM11或ADS-17型树脂中的一种，优选为HP-20、AB-8、DlOl型大孔吸附树脂；上样比例选择为:大孔吸附树脂的体积与穿山龙药材重量(干重)之比为0.5-1.5:1，即当穿山龙药材重量为100kg，则大孔树脂柱的柱体积为50-150L，优选为0.7-1.0:1 ;进一步的，大孔树脂柱分离处理过程中，大孔树脂柱的柱直径与柱高之比为1:8-20。
[0015]所述的步骤2)中的洗脱剂选依次采用水和含水的乙醇溶液，首先采用水为冲洗液进行冲洗，然后采用质量百分比浓度为20%-50%的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱，收集、合并含有原薯蓣皂苷的树脂柱洗脱液；其中，步骤2)中采用水为冲洗液进行冲洗的过程中，水与大孔吸附树脂的体积之比为2-6:1，优选为2-3.5:1 ;采用所述乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱的过程中，乙醇溶液与大孔吸附树脂的体积之比为4-6:1。
[0016]步骤3)中所述将含有原薯蓣皂苷的洗脱液浓缩，将提取液浓缩至相对密度为
1.0-1.2 ;所述的静置，可将浓缩提取液静置过夜(浓缩提取液的相对密度范围以及静置时间有利于杂质沉淀完全，便于后述分离制备)。
[0017]所述的步骤4)中的反相硅胶柱层析采用C18反相柱，所述的C18反相柱可选用预装柱或DAC制备柱；其中，步骤4)中所述反相硅胶柱分离，首先采用水为洗脱剂进行洗脱，然后采用质量百分比浓度为10%_50%的乙腈溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集、合并含有原薯蓣皂苷的洗脱液或者首先采用水为洗脱剂进行洗脱，然后采用质量百分比浓度为20%-60%的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱，收集、合并含有原薯蓣皂苷的洗脱液；其中，步骤4)中第二次反相硅胶柱层析处理过程中，选择乙腈与水的混合溶剂为洗脱剂，所述的乙腈溶液的质量百分比浓度为28%-40%，优选28%-35%。
[0018]进行反相柱分离时，采用多次含水乙醇作为洗脱溶剂或含水乙腈作为洗脱溶剂相结合，可进一步提高原薯蓣皂苷的纯度；例如，先使用含水乙醇作为洗脱剂，再使用含水乙腈作为洗脱剂，得到的原薯蓣皂苷纯度可达到90%以上。如再进一步采用反相柱层析，使用含水乙醇或者含水乙腈进行洗脱，可以进一步提高原薯蓣皂苷的纯度。
[0019]进一步的，步骤3)和步骤4)中所述的将含有原薯蓣皂苷的洗脱液浓缩，将提取液浓缩至相对密度为1.0-1.2。
[0020]反相树脂基填料比传统的C18硅胶具有更高的化学稳定性，可以在强酸、强碱介质下使用，可以用多种有机溶剂作为洗脱剂，可以在较高的浓度下使用，寿命非常长；反相树脂基填料吸附量高，颗粒均匀，机械强度好，不易破碎，残留物少，与相同粒径的C18固定相的柱效相当，无论对极性或非极性样品，几乎无不可逆吸附，非常适用于制备色谱分离纯化微量物质，而C8和C18柱由于硅醇基的存在，样品不可逆吸附到柱子上，使回收率低。
[0021]本发明中，对反相硅胶柱层析分离得到的产品进一步采用反相树脂基柱层析，gp在所述的步骤5)中的采用反相树脂基柱层析，以进一步提高原薯蓣皂苷的纯度；所选择反相树脂基填料可以为SMB、MC1、GEL、PRP型反相树脂基色谱柱中的一种，柱子规格选择预装柱或或DAC制备柱；其中，步骤5)中所述的反相树脂基柱层析处理过程中选择乙腈与水的混合溶剂为洗脱剂，其乙腈的溶液的质量百分比浓度为15%-35%。
[0022]进一步的，所述的穿山龙药材为菌科植物穿龙薯菌D1scoreanipponicaMakino的干燥根莖。
[0023]由于反相硅胶柱层析使用的反相硅胶粒径对分离效果亦有较大影响，理论上，粒粒径越小的反相硅胶，分离效果越好，但是柱压会明显升高，对设备的要求也相应增加，且反相硅胶的成本也会显著增加，故而本发明优选反相硅胶粒径为40-60 μ m的反相硅胶。
[0024]由于反相树脂基柱层析使用的反相树脂基粒径对分离效果亦有较大影响，理论上，粒径越小的树脂基填料，分离效果越好，但是柱压会明显升高，对设备的要求也相应增力口,且填料成本也会显著增加,故而本发明优选粒径为50-70 μ m的反相树脂基填料。
[0025]其中原薯蓣皂苷纯度检测如下:样品经高效液相色谱仪在色谱条件为:流动相为乙腈-水(26:74)，波长 203nm,色谱柱为 KromasirC18 色谱柱(4.6mmX 250mm, 5 μ m),流速为1.0mL ^irT1,柱温为35°C下检测，样品在HPLC色谱中为单一对称峰，由面积归一化法测定，纯度大于98%，色谱图见图2。
[0026]原薯蓣皂苷结构确定的方法如下:使用核磁共振波普仪，对样品进行分析，其中13C-NMR(400MHz, Pyridine-d5) δ:37.5 (C-1)，30.2 (C_2)，78.2 (C_3)，39.0 (C_4)，140.9(C-5), 121.8 (C-6)，32.4 (C_7), 31.7 (C_8)，50.4 (C_9)，37.1 (C-1O), 21.1 (C-1l)，40.0 (C-12)
，40.8 (C-13)，56.6 (C-14)，32.5 (C-15), 81.1 (C-16)，63.8 (C-17)，16.5 (C-18)，19.4 (C-19)
，40.7 (C-20)，16.3 (C-21), 110.7 (C-22)，37.1 (C-23)，28.3 (C-24)，34.3 (C-25)，75.2 (C-26)，17.4(C-27) ;C-3 糖分:100.3(GlcC-l' ), 77.9 (GlcC-2; (inner))，78.2 (GlcC-3' ),79.0(GlcC-4/ ),76.8(GlcC-5/ )61.4(GlcC-6/ ) ; 102.0(RhaC-l" )，72.4(RhaC_2" (I —2)),72.8(RhaC-3" )，74.l(RhaC-4" )，69.4(RhaC_5" )，18.4 (RhaC_6〃)，102.9 (RhaC-1" ' ),72.4(RhaC-2" ' (1^2)),72.7(RhaC-3" ' ), 73.9(RhaC-4" ' ), 70.5(RhaC-5" ' ), 18.6(RhaC