一种长牡蛎补体样分子CgC1qDC-1重组蛋白及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种长牡蛎补体样分子CgClqDC-I重 组蛋白及其制备和应用。
【背景技术】
[0002] 固有免疫系统（innate immunity)是免疫系统的重要组成部分，是宿主抵御病原 入侵的第一道防线。无脊椎动物缺乏适应性免疫系统（adaptive immunity)，因此仅能依靠 固有免疫抵御病原入侵。固有免疫主要通过抗菌肽/蛋白和吞噬作用杀伤并清除病原物， 因此，对病原物的识别是诱发免疫反应的关键步骤。病原入侵宿主过程中，伴随其感染和 复制，会产生一系列保守组分，称为病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns, PAMPs)，这些PAMPs能够被宿主免疫细胞表面的模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs)有效识别，进而诱导一系列的免疫级联反应。目前，无脊椎 动物中已发现了十余类识别受体，如肽聚糖识别蛋白（PGRP)和Toll样受体等，它们通过 结合不同的病原相关分子模式完成对各种病原微生物的识别，在诱导细胞因子和炎症的产 生、抗菌肽的表达、激活酚氧化酶级联反应和吞噬作用等一系列固有免疫应答中发挥重要 作用。因此，对模式识别受体的鉴定和功能研宄一直是免疫学研宄的热点。
[0003] 补体系统是固有免疫的重要组成部分，具有调理吞噬、介导炎症、溶解细胞和调 节免疫应答等生物学功能。补体分子Clq(Complement Iq)是补体系统经典途径的重 要识别分子，能够启动经典途径，并且在固有免疫和适应性免疫之间发挥重要的桥梁作 用。现已在无脊椎动物中发现众多包含Clq球状结构域的补体样分子ClqDC蛋白（Clq domain-containing protein)，该类蛋白在无脊椎动物免疫防御和病原清除等方面发挥关 键作用。因此，对补体样分子的发掘和利用有助于我们明确牡蛎免疫系统识别病原物的机 制，揭示牡蛎免疫系统诱发和清除病原物的规律，最终为牡蛎病害防治、药物研发和良种选 育提供理论基础。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种长牡蛎补体样分子CgClqDC-I重组蛋白及其制备和 应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
[0006] -种长牡蛎补体样分子CgClqDC-I重组蛋白，CgClqDC-I基因重组蛋白为序列表 SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示。
[0007] -种长牡蛎补体样分子CgClqDC-I重组蛋白的制备，
[0008] (1)以长牡蛎补体样分子CgClqDC-I编码区为模板，采用Pl和P2引物进行PCR扩 增，待用；
[0009] (2) PCR扩增产物与将pEASY-El载体通过T4连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；
[0010] (3)将上述构建载体转入Transetta(DE3)表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、 复性，即得到具有序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重组蛋白CgClqDC-I ;
[0011] 所述引物 Pl 和 P2 分别为 Pl :5' -ATGTCCCAAAATGTTTTGATC-3' ；P2 : 5' -GGCCAGTTTGAATCCAGAG-3'。
[0012] 一种长牡蛎补体样分子CgClqDC-I重组蛋白的应用，所述序列表SEQ ID NO. 1中 氨基酸序列的CgClqDC-I重组蛋白用于制备病原菌识别或促吞噬活性的制剂。
[0013] 本发明所具有优点：
[0014] 本发明中的长牡蛎补体样分子CgClqDC-I为包含Clq球状结构域的补体样分子 ClqDC蛋白，其重组蛋白对革兰氏阴性菌的病原相关分子模式脂多糖具有较高的结合活性； 同时，该蛋白能够增强长牡蛎血淋巴细胞对革兰氏阴性菌的吞噬能力。本发明的对长牡蛎 补体样分子CgClqDC蛋白的研宄，有利于深入揭示长牡蛎固有免疫作用机制，充分挖掘和 利用海洋来源基因资源，在开发抗菌类药物和新型免疫增强剂、饲料添加剂等方面具有潜 在应用价值，同时为海洋经济养殖动物的病害防治提供重要物质基础和理论支持。
【附图说明】
[0015] 图1为本发明实施例提供的长牡蛎补体样分子CgClqDC-I基因重组蛋白对革兰 氏阴性菌病原相关分子模式脂多糖具有较强结合活性图。其中，如图A所示，拉下实验 (pull down)表明，CgClqDC-I对LPS具有较高的结合特异性；图B所示，酶联免疫吸附实验 (ELISA)表明，CgClqDC-I对LPS结合能力较强，解离常数Kd值为0. 09 X ΙΟ-%。
[0016] 图2为本发明实施例提供的长牡蛎补体样分子CgClqDC-I基因重组蛋白增强血淋 巴细胞对大肠杆菌和灿烂弧菌的吞噬作用图；其中，如图A所示，相比于对照组，CgClqDC-I 处理能够显著性上调血淋巴细胞对大肠杆菌（上图）和灿烂弧菌（下图）的吞噬比例；图 B为CgClqDC-I上调血淋巴细胞吞噬比例的统计学分析图。
【具体实施方式】
[0017] 下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
[0018] 实施例1 :长牡蛎补体样分子CgClqDC-I基因编码区的体外原核重组表达，包括下 列步骤：
[0019] 1、重组载体的构建
[0020] 本发明中采用的重组表达载体为北京全式金公司的pEASY-El原核表达载 体。通过PCR技术，使用基因特异性引物Pl (5' -ATGTCCCAAAATGTTTTGATC-3'）和 P2(5' -GGCCAGTTTGAATCCAGAG-3'）。扩增长牡蛎补体样分子CgClqDC-I基因的编码区片 段。反应条件为：首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环：94°C变性30秒，50°C退火 30秒，72°C延伸30秒，共进行32个循环，最后72°C延伸10分钟。将PCR产物纯化回收，与 pEASY-El载体连接。转化后菌落PCR筛选并测序，提取阳性克隆质粒，完成载体的构建。
[0021] 2、重组蛋白的表达
[0022] 以Transetta (DE3)为重组表达菌株，将上述构建的重组载体转化到表达宿主菌 中，挑取单克隆，提取质粒，测序验证读码框正确。挑取单克隆，接种于5mL LB液体培养基 中，37°C震荡摇床中培养12-16小时，然后以I :100的比例接种200mL LB液体培养基中， 37°C培养至0D600 :0. 5-0. 7。加入IPTG，使终浓度达到0. 5mM ι?ΙΛ继续培养5小时。4°C， 6000rpm，离心10min，收集菌体，于-20°C冻存备用。取ImL菌液离心，弃去上清后，加入 80 μ L水和20 μ L 5X蛋白上样缓冲液，100°C沸水煮沸10分钟，SDS-PAGE检测表达产物。
[0023] 3、重组蛋白的纯化
[0024] 将上述所得大肠杆菌总蛋白采用镍琼脂糖凝胶层析柱纯化获得重组蛋白，并透析 除盐。
[0025] 具体操作步骤如下：
[0026] 镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化带His标签的重组蛋白
[0027] (1)镍琼脂糖凝胶亲和层析柱，I X 10cm，柱床体积为7mL