一种布氏菌疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种布氏菌及其疫苗，用于布氏菌病的预防及免疫治疗，属于疫苗生 产技术领域。
【背景技术】
[0002] 布鲁氏菌病（简称布病）是由布鲁氏菌属引起的一类人畜共患疾病。可通过口腔 粘膜、鼻腔、眼结膜、生殖道、甚至未损伤的皮肤而感染。家畜感染后可引发母畜流产和不 育，人感染则主要引起波浪热和转化为慢性感染。据调查，全球已有170多个国家和地区有 布病发生和流行。
[0003] 我国50~60年代在我国人畜中有较重流行，自70年代布病疫情逐年下降，至90 年代初人间感染率仅为0.3%，发病率只有0.02/10万。但自1993年布病疫情出现了反弹， 1996年全国发病率为0. 09人/10万人，2013年发病率升为3. 36人/10万人。十几年间， 发病率已经增加近40倍，2013年卫计委报告新发病人数多达46, 289人。这个现象与世界 上部分地区的布病疫情遥相呼应。该状态已引起世界和我国有关部门的关注。
[0004] 目前，接种疫苗是世界公认的能够降低布病的发生和传播最有效的、最经济的方 法。疫苗接种的方法有滴鼻、注射、气雾及皮肤划痕等。我国目前采用的是牛种弱毒株104M 菌株，为人用皮上划痕布氏菌活疫苗，按照《中华人民共和国药典》三部的要求，该疫苗种子 批为光滑型细菌，粗糙型不高于3%，成品中粗糙型不高于10%。104M菌株传代稳定性差， 易发生变异，且菌株本身还有一定残余毒性，接种后常伴有局部或全身的异常反应，其安全 性一直存在较大争议。国内外有学者对布氏疫苗的改造进行了深入的研宄和探索，目前仍 存在对稳定且安全的布氏菌疫苗的需求。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种牛布氏杆菌(Brucella abortus) 104MR,该牛布氏杆菌为耜織 型，其与现有技术已有的104M菌株相比，具有更好的传代稳定性和更高的安全性，同时还 具有较好的免疫效果。
[0006] 本发明的粗糙型的牛布氏杆菌104MR(以下简称粗糙型布氏菌104MR)是通过将光 滑型104M菌株经连续高温传代使之发生突变后分离得到的一种新的粗糙型布氏菌株，其 三胜黄素凝集反应阳性、热凝集试验阳性和结晶紫试验阳性，保藏单位为中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期 为2015年2月10日，保藏号为CGMCC No. 10330。
[0007] 本发明的粗糙型布氏菌104MR具有更好的传代稳定性。本发明的粗糙型布氏菌 104MR菌株在体外连续传5代，经结晶紫试验检测，均无变异产生；而光滑型104M菌株在体 外连续传5代，经结晶紫试验检测，变异率为I. 1 %。
[0008] 本发明的粗糙型布氏菌104MR具有更高的安全性。本发明的粗糙型布氏菌104MR 菌株注射小鼠，半数致死量为2. 2 X IOltl个菌，而光滑型104M菌株的半数致死量为2. 2 X 109 个菌。另外，将本发明的粗糙型布氏菌104MR菌株与光滑型104M菌株分别注射小鼠，每只 动物均腹腔注射5 X IO7个菌，28天后解剖分离脾脏活菌数，本发明菌株免疫动物脾脏活菌 数（Iogltl)为2. 58,而光滑型104M菌株免疫动物脾脏活菌数（Iogltl)为6. 27,本发明菌株比 光滑型104M菌株脾脏活菌数低近4个数量级。以上结果表明本发明的粗糙型布氏菌104MR 菌株毒性远低于现有的光滑型104M菌株。
[0009] 本发明的粗糙型布氏菌104MR对布氏菌感染具有较好的预防效果。本发明的粗 糙型布氏菌104MR菌株免疫小鼠后用羊种M5弱毒菌株攻击，4周后解剖分离脾脏活菌数 (Iog ltl)为2. 29,而光滑型104M菌株免疫小鼠的脾脏活菌数为2. 02,二者差异无统计学意 义（P > 0. 05)。另外，本发明的粗糙型布氏菌104MR菌株免疫豚鼠后用羊种M5弱毒菌株攻 击，3周后解剖分离脾脏活菌数（Iog ltl)为2. 28,而光滑型104M菌株苗免疫豚鼠的脾脏活菌 数（Iogltl)为2. 26,二者差异无统计学意义（P > 0. 05)。以上结果表明本发明的粗糙型布 氏菌104MR菌株预防效果与现有的光滑型104M菌株基本一致。
[0010] 另外，本发明的粗糙型布氏菌104MR对已感染布氏菌的动物还显示出较好的免疫 治疗效果。将小鼠用羊种M5弱毒菌株感染，感染1个月后用本发明的粗糙型布氏菌104MR 进行免疫治疗，治疗1个月后进行解剖分离脾脏活菌数，治疗组小鼠脾脏荷菌数（Iogltl)为 3. 05,未治疗生理盐水对照组脾脏荷菌数（Iogltl)为5. 17,差异显著（P < 0. 05);治疗3个 月后治疗组小鼠脾脏荷菌数均为0,未治疗生理盐水对照组脾脏荷菌数（Iogltl)为1.94,差 异明显。
[0011] 本发明还涉及用于预防或免疫治疗布氏菌病的疫苗组合物，含有粗糙型布氏菌 104MR。本发明的疫苗组合物，可以不含有除粗糙型布氏菌104MR之外的其他布氏菌，也可 以还含有光滑型布氏菌104M。如果还含有光滑型布氏菌104M，粗糙型布氏菌104MR与光滑 型布氏菌104M的摩尔比至少为1:9,优选至少2:8,进一步优选至少3:7,进一步优选至少 4:6,进一步优选至少5:5,进一步优选至少6:4,进一步优选至少7:3,进一步优选至少8:2， 最优选至少9:1。
[0012] 本发明的疫苗组合物为活疫苗，可以是冻干制剂，在冻干前，每升中含有 IX 10n-5 X IO14个布氏菌，优选含有约5 X 10 11个布氏菌。进一步，本发明的制剂中还含有 冻干保护剂，例如，在冻干前，每升中还含有海藻糖40-60g、谷氨酸钠4-6g、硫脲4-6g和蔗 糖40-60g，余量为灭菌注射用水；优选每升中含有海藻糖约50g、谷氨酸钠约5g、硫脲约5g 和蔗糖约50g，余量为灭菌注射用水。
[0013] 本发明还涉及粗糙型布氏菌104MR在制备用于预防或免疫治疗哺乳动物布氏菌 病的疫苗中的应用。本发明的疫苗优选通过皮内接种、鼻腔接种、皮下接种或皮上划痕接 种。优选哺乳动物为人、牛、羊、犬或猪。
[0014] 本发明的疫苗组合物可以按照本领域已知的各种方法制备。例如，本发明的冻干 制剂的制备方法可以包括如下步骤：将粗糙型布氏菌104MR的种子批传代培养，收获时用 冻干保护剂洗下菌苔或刮取菌苔于冻干保护剂内，得原液；用冻干保护剂将原液稀释至所 需浓度，例如，IX l〇n_5X IO14个/L，优选5X 10 11个/L ;分装，例如，每安瓿含0. 5ml (5次人 用剂量）；冻干，得成品。其中所使用的冻干保护剂可以每升含有海藻糖40-60g、谷氨酸钠 4_6g、硫脲4-6g和鹿糖40-60g，