无外源诱导人多能干细胞为gaba神经元的方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种无外源性高效诱导人多能干细胞为GABA神经元的方法及应用，属于生物医学技术领域。
【背景技术】
[0002]近年来，随着社会老龄化程度的加重，神经退行性疾病渐渐成为人们关注的焦点。由于人诱导多潜能干细胞技术的发展，以及动物实验取得的初步成效，应用该技术治疗中枢神经系统疾病展示出了广阔的前景。
[0003]传统观点认为，成年哺乳动物神经元一旦受损就无法再生。这种观点使许多神经退行性疾病的治疗受到了极大的限制。虽然药物及手术取得了进展，但仍无法获得满意的疗效。目前，由于干细胞技术发展的日新月异，干细胞疗法治疗神经退行性疾病也日趋获得了人们的重视。细胞移植是修复和替代受损神经组织的有效方法，能够重建部分环路和功能，对神经系统疾病的治疗具有深远的意义。
[0004]许多神经性障碍由于大脑内兴奋性神经元和抑制性神经元失衡所致异常放电导致。例如癫痫(Epilepsy)，精神分裂症(Schizophrenia)，自闭症(Autism)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)等。大脑皮质中广泛存在着两种细胞，一种是兴奋型投射神经元，另一种是抑制型中间神经元。大量的研宄报道表明，大部分的神经性障碍及神经退行性疾病均与这两种神经元之间有关。在大脑皮质中，广泛存在着抑制型神经元γ-氨基丁酸神经元(GABA神经元)。GABA神经元起源于腹侧胎脑，内神经节隆起(Medial Gangl1nicEminences, MGE)。作为一种典型的抑制型神经元，GABA神经元多被认为与学习记忆功能息息相关。在生长发育的过程中，GABA神经元通过长距离的切线迀移至大脑皮质。细胞移植可通过模拟及重塑神经环路为癫痫，帕金森病，情感障碍和神经痛等疾病提供新的治疗方法。
[0005]近年来，人多能干细胞定方向分化领域发展迅速，由于其具有的自我更新，高度繁殖和分化潜能等特征，人们已经可以在体外培养出多种干细胞，并将其诱导成所需的细胞类型。随着技术的进步和发展，已有文献报道可将人多能干细胞分化至多种前脑腹侧神经元。但现有的分化方法仍存在一些缺陷，包括培养液繁复，分化过程不能排除外源因素的干扰，分化效率不高等。以后若进一步应用细胞移植治疗神经推行性疾病，排除外源因素的干扰是首要条件之一。
【发明内容】
[0006]发明目的:本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种无外源诱导人多能干细胞为GABA神经元的方法。具体涉及通过神经诱导培养液及Sonic Hedge (SHH)或其激动剂小分子化合物Purmophomine使人多潜能干细胞分化至前脑γ -氨基丁酸能(GABAergic)中间神经元的方法。该方法可明显改善培养液繁复，分化效率不高以及排除外源因素的干扰。
[0007]技术方案:本发明所述的无外源性高效诱导人多能干细胞为GABA神经元的方法，包括以下步骤:
[0008]I)在基质胶Matrigel或者Vitronectin的系统下培养人多能干细胞，直至达到60% -80%的密度；
[0009]2)将步骤I得到的人多能干细胞用Dispase或EDTA消化，然后当日以神经诱导分化悬浮液培养，该日记为第O天；
[0010]3)待可观察到人多能干细胞形成的拟胚体球Embryoid body EB时，加入神经诱导分化液继续培养；
[0011]4)第7天进行贴壁操作；
[0012]5)第10天加入音猜因子SHH或者小分子化合物Purmophine进行持续诱导；
[0013]6)第16天时将形成的类神经管结构吹下，并将吹下的类神经管结构用添加有SHH或Purmophine的神经诱导液持续诱导培养；
[0014]7)第22天即得所述GABA神经元。
[0015]进一步地，所述步骤2)中的神经诱导分化悬浮液为含有I %体积分数的N2培养基、0.1mMol/L非必须氨基酸的神经诱导分化液。
[0016]进一步地，所述神经诱导分化悬浮液还包括0% — 50%体积分数的无饲养层人多能干细胞培液E8。
[0017]进一步地，其特征在于，在所述步骤4)中，在贴壁前培养皿或培养板上提前铺人源性的基质胶Vitronectin以促进其贴壁。
[0018]进一步地，所述步骤5)中加入含有100-1000ng/ml音猬因子SHH或者0.5-2 μMol/L小分子化合物Purmophine的神经诱导液持续诱导6±1天。
[0019]进一步地，所述步骤6)中重悬后，加入含有100-1000ng/ml音猬因子SHH或者0.5-2 μ Mol/L小分子化合物Purmophine的神经诱导液持续诱导10±2天。
[0020]进一步地，本发明还包括上述的诱导人多能干细胞分化为GABA神经元方法直接得到的为GABA神经元作为移植治疗神经退行性疾病药物的应用。
[0021]本发明的人多能干细胞首先在在无饲养层的体系中进行培养，不同于传统方法使用的小鼠成纤维饲养层(MEF)，本方法中使用了基质胶Vitronectin或Matrigel作为基底培养人多能干细胞。然后通过添加神经诱导培养液及Sonic Hedge (SHH)或其激动剂小分子化合物Purmophomine使人多能干细胞分化至GABA神经元，整个过程均无异源因素的干扰。
[0022]本发明与现有技术相比，其有益效果是:本发明的诱导分化方法是高效定向分化无饲养层的人多能干细胞至γ-氨基丁酸中间能神经元，现存的技术培养人多潜能干细胞依赖动物饲养层或分化效率较低。(Woodard, C.Μ.，et al.，iPSC-derived dopamineneurons reveal differences between monozygotic twins discordant for Parkinson’sdisease.Cell Rep, 2014.9(4):p.1173-82.)本发明的技术方案在诱导分化的第4周可以获得85.16±1.34%的γ-氨基丁酸中间能神经元。目前已发表文献中饲养层分化出GABA神经元的效率约为90%，本方法的分化效率与已发表文献中饲养层分化出的GABA神经元效率相似，但本方法优于现存技术在于无异源因素影响。(Liu, Y.，et al.，Directeddifferentiat1n of forebrain GABA interneurons from human pluripotent stemcells.Nat Protoc, 2013.8(9):p.1670-9.)此外，目前不依赖与动物饲养层的人多潜能干细胞的分化效率约为30%左右，本方法的分化效率远高于现存不依赖动物饲养层的人多潜能干细胞培养的分化效率。(Woodard, C.M.，et al.，iPSC-derived dopamine neuronsreveal differences between monozygotic twins discordant for Parkinson’sdisease.Cell Rep, 2014.9(4):p.1173-82.)且与现存技术相比较，本方法排除了动物源干扰，且用到的小分子化合物较少，而获得的GABA神经元的效率却明显高于现有技术的分化方法。且本方法操作简便，可重复性高。
【附图说明】
[0023]图1是无异源性人多能干细胞来源的GABA神经元，其中显示了诱导无饲养层人多能干细胞分化至GABA神经元的全过程。A图表示整个分化过程仅使用了神经诱导分化液，神经上皮细胞出现时加入SHH/Purmophine进行诱导分化最终获得高效率的GABA神经元，Bar = 100ym;B图为现有常用方法下对照组和神经诱导分化液诱导所获得的EB平均面积比较图，可看出使用神经分化液1，4，7天所获得的EB平均面积明显高于对照组；C图为对照组和神经诱导分化液6孔板每孔可获得的EB个数；*，p〈0.1 ;**，p〈0.01。
[0024]图2为分化至第10天出现的典型的神经管状结构示意图，图中可见明显的玫瑰花换状结构，Bar = 100 μ mD
[0025]图3为对第10天出现的神经管状结构的进行Pax6和Sox2的免疫组化染色结果，左图为Hochest和Pax6的免疫组化染色，右图为Hochest和Sox2的免疫组化染色，可见大部分细胞均为共标，Bar = 50 Um0
[0026]图4为对分化至第25天的GABA神经元进行Foxgl和Nkx2.1的免疫荧光染色，Bar=50 μ m0
[0027]图5是第25天对细胞进行Foxgl和Nkx2.1进行免疫荧光染色，Foxgl和Nkx2.1阳性细胞占总细胞的百分比，Foxgl的阳性率为88.61±1.19%, Nkx2.1的阳性率为81.32±2.15%。
[0028]图6为对分化至第35天的GABA神经元进行Tuj-1和GABA的免疫荧光染色，Bar=50 μ m0
[0029]图7是第35天对细胞进行Tuj-1和GABA进行免疫荧光染色，Tuj-1和GABA阳性细胞占总细胞的百分比，Tuj-Ι的阳性率为88.61 ± 1.19%，GABA的阳性率为81.32±2.15%。
[0030]图8图4为对分化至第45天的GABA神经元进行GAD67和MAP2的免疫荧光染色，Bar = 50 μ m0
[0031 ] 图9是第45天对细胞进行GAD67和MAP2进行免疫荧光染色，GAD67和MAP2阳性细胞占总细胞的百分比，GAD67的阳性率为93.15 ± 1.34 %，MAP2的阳性率为75.21 ± 2.34 %。
【具体实施方式】
[0032]下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
[0033]实施例1:
[0034]本实施例的培养方法，主要将无饲养层培养的人多能干细胞经过消化、悬浮、贝占壁、再悬浮等过程获得纯度较高的GABA神经元。
[0035]本实施例包括以下步骤:
[0036](I)在无饲养层的体系中培养人多能干细胞；
[0037](2)将人多能干细胞消化后，制成细胞球，将换培养基为一定比例的神经诱导分化液；
[0038](3)使用神经诱导分化液培养6±1天后，提供细胞贴壁条件，使细胞贴壁生长；
[0039](4)第 10±1 天，以音猜因子(Sonic hedgehog ；SHH)或小分子化合物 Purmophine进行持续诱导；
[0040](5)音猜因子或Purmophine诱导6天后，将形成有神经管结构的细胞(Rosette)吹起重悬；
[0041](6)吹起重悬后，仍以音猜因子或Purmophine继续诱导悬浮培养8±2天后收获细胞球，可获得高纯度的γ -氨基丁酸能中间神经前体细胞。
[0042]本实施例第4周实测可以获得85.16± 1.34%的γ -氨基丁酸中间能神经元。
[0043]本实施例中的神经诱导分化培液中，含有Dulbecco’ s Modified EagleMedia:Nutrient Mixture F-121:1 (DMEM:F12)，5ml 非必需氨基酸(MEM, non-essentialamino acids solut1n, NEAA), 5ml的N2复合物，将所有成分加入DMEM:F12培养基后定容至500ml，过滤后备用。
[0044]本发明中，首先吸除无饲养层培养的人胚胎干细胞的培养液，然后加入Dispase酶或EDTA，于37°C培养箱消化2分钟，显微镜下可观察到人多能干细胞克隆明显卷边，迅速吸去消化酶液，加入预热