一种β-琼胶酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能基因筛选技术领域，具体涉及一种β-琼胶酶及其应用。
【背景技术】
[0002] 琼胶广泛存在于江蓠、石花菜等红藻的细胞壁，是一种重要的海藻多糖。琼胶结构 复杂，由1，3连接的β -D-半乳吡喃糖和1，4连接的3, 6-内醚-a -L-半乳吡喃糖残基反 复交替连接组成骨架，并包含硫酸基、甲基等取代基。琼胶酶是指一类能够降解琼胶，生成 琼胶寡糖的糖苷水解酶，其主要来源是海洋细菌，少部分来源于陆地环境中的细菌和海洋 软体动物。琼胶酶分类方式多样，根据琼胶酶降解琼脂糖时作用的糖苷键和产物的不同， 琼胶酶可分为两大类：α -琼胶酶和β -琼胶酶。α -琼胶酶作用于琼脂糖的α -1，3糖苷 键，生成琼寡糖；β -琼胶酶作用于β -1，4糖苷键，降解产物为新琼寡糖。根据序列相似性， β-琼胶酶通常被划分到四个糖苷水解酶家族（GH，GlucosideHydrolase):分别是GH16、 GH50、GH86和GH118家族；而α-琼胶酶则属于GH96家族。根据作用方式不同，可以将琼 胶酶分类为内切酶和外切酶。通常情况下，内切酶（大多数的GH16、GH86和GH118家族的 琼胶酶）作用于多糖长链的内部，以较大聚合度的寡糖分子为降解的终产物；而外切酶（大 多数的GH50家族的琼胶酶）作用于多糖或高聚合度寡糖的两端，产生低聚合度的寡糖或单 糖供细胞进一步的降解利用，在多糖的降解过程中起重要作用。
[0003] 琼胶酶降解琼胶所产生的琼胶寡糖具有多种生理活性，具有抑菌性，并且具有明 显的抗肿瘤和免疫增强效应。新琼二糖对肠道菌群的生长还具有益生元效应。利用琼胶酶 降解琼胶生产琼胶寡糖具有专一性和高效性、条件温和、产物易于回收等特点，是未来获取 琼胶寡糖的主要方向。除此以外，利用琼胶酶降解琼脂糖凝胶回收胶条中的DNA或RNA、降 解海藻细胞壁以制备原生质体、水解海藻多糖以分析多糖结构等，也是琼胶酶在分子生物 学研宄中的重要应用。由于能源危机和全球变暖等气候问题，生物乙醇作为一种可持续的 生物燃料成为现在的研宄热点。利用琼胶酶和α-新琼寡糖降解酶将结构复杂的琼胶多糖 转化成单糖，再通过糖化作用和发酵作用将单糖转化为酒精。因此，将红藻高效地转化为生 物酒精也是琼胶酶的一个重要应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种β-琼胶酶及其应用，从而弥补现有技术的不足。
[0005] 本发明提供一种β -琼胶酶，包含有
[0006] 1)氨基酸序列为SEQ ID NO :1的β -琼胶酶；
[0007] 2)在1)进行取代、缺失、添加一个或几个氨基酸形成的，且具有1)中酶学性质的 β-琼胶酶；
[0008] 编码上述β -琼胶酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO :2 ;
[0009] 本发明还提供一种重组大肠杆菌，转化有携带上述基因的表达质粒。
[0010] 上述的重组大肠杆菌，为大肠杆菌YM01-5 (Escherichia coli YM01-5)，于2015 年3月25日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:M2015164〇
[0011] 本发明的β -琼胶酶5用于制备新琼寡糖，例如新琼二糖。
[0012] 本发明的β-琼胶酶酶能够特异性地降解琼胶产生唯一的降解产物一一新琼二 糖。本发明的大肠杆菌重组株YM01-5/pET24a(+)、BL21(DE3)所表达的重组β-琼胶酶，表 达水平高，易于纯化，所以通过本发明可以大量生产重组β -琼胶酶，成本低。
【附图说明】
[0013] 图1 :薄层层析检测琼胶酶ΥΜ01-5的降解产物图，
[0014] 图2 :重组琼胶酶ΥΜ01-5降解产物（新琼二糖）的离子肼质谱图。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。
[0016] 实施例1 : β -琼胶酶基因 YMO1-5的获取
[0017] 嗜琼胶卵链菌（Catenivulum agarivorans gen. nov. sp. nov.) YMOIt由本实验室 筛选、鉴定、保藏，通过对其全基因组进行测序分析得到15个琼胶酶基因及其基因序列，包 括13个β-琼胶酶基因和2个α-琼胶酶基因，ΥΜ01-3是其中的一个β-琼胶酶基因。利 用生物学软件 Primer5. 0 设计上游引物（5'-GGATCCGATGAAATATCTAGATTACGGTTATAGCC-3'） 和下游引物（5' -CCCTCGAGTTTGCTGTCAGCCTGCACTTG-3'）以基因组DNA为模板，进行PCR反 应，PCR反应组成如下（10 μ 1反应体系）：ddH20 10. 5 μ 1、上游和下游引物各0· 5 μ 1，DNA 模板 1 μ l、2XMasterMix 12. 5 μ 1。反应条件为：94°C预变性 5min，94°C变性 lmin，64°C 退火lmin，72°C延伸I. 5min，72°C终延伸lOmin，共30个循环。反应结束后，将PCR产物回 收得到β-琼胶酶基因 YM01-5,其具体核苷酸序列为SEQ ID NO :2,其翻译的酶的氨基酸 序列为 SEQ ID N0:1。YM01-5 和来自于 Cellvibrio sp.BR 的 agarase(WP_007640756.1) (相似度 63 % )、Glaciecola agarilytica 的 beta-agarase B(WP_008306471. 1)(相 似度 59 % )，Thalassomonas agarivorans 的 beta_agarase(AGT98631. 1)(相似度 57 % )，Saccharophagus degradans 2_40 的 Exo-beta-agarase (4BQ2)(相似度 58 % )， Alteromonas sp. E-1 的 beta_agarase(BAE97587. 1)(相似度 62% )。上述结果表明本发明 筛选得到了一个新型的琼胶酶基因。
[0018] 实施例2 :大肠杆菌表达载体YM01-5/pET24a(+)的构建
[0019] 将PCR产物和表达载体pET24a(+)分别用BamH I和Xhol I双酶切，酶切体系 (20 μ 1)如下：
[0020] 反应体系 I :ddH20 8 μ 1，PCR 产物 8 μ 1，BamH Il μ 1，Xhol Il μ 1，IOXBuffer 2 μ I
[0021] 37°C酶切1小时，电泳后分别回收两个目的片段2409bp和5. 3Kb，二者分别与 β-琼胶酶YM01-5基因全长片段和表达载体PET24a(+)片段大小相同，用DNALigation Kit 连接，连接体系（1〇μ1)如下：Solution I 5yl，DNA 片段 1.5yl，pET24a(+)载体 L ΙμL， CldH2O 2. 4 μ 1。16°C连接16小时即可获得大肠杆菌表达载体YM01-5/pET24a(+)，用于转化 大肠杆菌BL21(DE3)。
[0022] 实施例3:大肠杆菌重组株YM01-5/pET24a(+)/BL21(DE3)的构建
[0023] 向200 μ IE. coliBL21感受态细胞中加入10 μ lYM01-5/pET24a(+